一种基于微流控纸芯片技术的茶多酚含量快速检测方法与流程

本发明涉及一种基于微流控纸芯片技术的茶多酚含量快速检测方法。

背景技术：

多酚类物质因其潜在的健康促进作用近年来引起研究者的广泛关注，其总含量是诸多产品(如茶叶、红酒、可可等)品质检定中的重要参数之一。基于福林酚显色反应的分光光度法是发展最早的多酚总量检测方法，且由于其本身具有仪器设备简单、操作方便、测定结果准确等优势，是目前世界范围内最为广泛采用的食品中多酚总量测定方法，也是我国茶多酚制品与茶叶中多酚总量的现行国家标准测定方法。

但是鉴于方法所涉及的磷钨钼酸-多酚氧化还原显色体系反应非常缓慢(文献报道一般认为反应需30-90min达到较稳定状态)，而常规分光光度检测中对各待测样品需逐个操作进行光度法测定，为避免平行测定过程中各个反应的显色进行程度差异造成测量误差，目前的实际检测均需等待显色反应完全结束后的稳定状态阶段进行(以保证待测溶液吸光度不再随时间变化)。因此，目前一般文献研究及实际实验室检测中仍推荐显色反应2小时后进行分光光度测定，整个测试过程耗时费力。而且，福林酚反应本身的动力学特性决定了常规检测方法在时间效率上的提高和进步空间非常有限，新型的多酚含量快速检测方法亟待开发。

技术实现要素：

本发明旨在解决现有茶多酚含量检测中福林酚-茶多酚显色反应速度慢、试剂用量大、检测耗时长的问题，提供一种新的茶多酚含量快速检测方法。该方法具有操作方便、设备简单、试剂用量小、检测时间短等显著特点。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于微流控纸芯片技术的茶多酚含量快速检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)采用区域选择性表面改性技术在纸基底上制备设置有对称性亲水通道网络的微流控纸芯片，所述微流控纸芯片由疏水区和对称性亲水通道网络组成，所述疏水区完全包围所述对称性亲水通道网络，所述对称性亲水通道网络包括中心区、环绕中心区的多条亲水通道，每条亲水通道的一端与中心区连通，远离中心区的一端设置反应检测区，所述多条亲水通道长度和宽度相等，并以中心区为对称点形成点对称；

所述亲水通道为4条以上，优选8～12条；

(2)在纸芯片的各个检测区分别滴加0.5μL～3μL(优选为1.5μL)的福林酚试剂(Folin-Ciocalteu试剂)，自然晾干后，用于下一步检测；所述福林酚试剂为2N的福林酚母液稀释5～20倍制得(优选稀释7倍)

(3)分别取0.5μL～3.0μL(优选为1.0μL)的空白溶液、标准溶液和待测样品溶液滴加至步骤(2)的纸芯片的不同检测区中，室温下放置，挥发至干，从而分别对应得到空白检测区、标准溶液检测区和待测样品检测区；

所述空白溶液为去离子水；所述标准溶液为没食子酸标准物的水溶液，浓度范围为5μg/ml～100μg/ml；

(4)将上述处理好的芯片水平放置，并在其中心区滴加10～50μL(优选30μL)7.5％的Na₂CO₃水溶液，使其在纸纤维毛细管作用力的作用下通过亲水通道自然流动扩散至各检测区，进行显色反应，显色1-10min(优选显色时间为1min～5min)，进行茶多酚半定量检测或定量检测；

所述半定量检测为：通过肉眼观察并对比待测样品区与标准溶液检测区的颜色强度差异，判断待测样品溶液茶多酚含量大致范围，实现待测样品溶液中茶多酚含量的半定量检测。

所述定量检测为：对显色后的芯片进行整体图片采集，通过图像处理软件分析获得各检测区的颜色强度数据；将标准溶液检测区和待测样品检测区的颜色强度分别扣除空白检测区的颜色强度，依次得到各个标准溶液的颜色强度和待测样品溶液的颜色强度；

以标准溶液中没食子酸浓度为横坐标、相应检测区颜色强度为纵坐标，绘制工作曲线并拟和得到标准曲线方程；由标准曲线方程和待测样品的颜色强度数据，计算得到待测样品溶液中的多酚总量。

所述步骤(1)中，优选所述纸基底为定性分析滤纸；

所述采用区域选择性表面改性技术在纸基底上制备设置有对称性亲水通道网络的微流控纸芯片，所述区域选择性表面改性技术可以为蜡印技术、化学试剂改性结合真空等离子体处理技术、改性结合紫外光降解技术、化学试剂改性结合电晕处理技术等，这些都是制备具有亲疏水图案的微流控纸芯片的公知技术。

所述反应检测区优选为圆形，所述中心区优选为圆形。

囿于本发明所涉反应体系的特殊性，所述对称性亲水通道网络应有较严格的限制：为减小测量误差，同时保证显色液快速充满反应检测区，各反应检测区直径限定在4mm～7mm之间，以5mm为佳；为确保亲水通道能快速、同时将显色液运输到各显色区，亲水通道应尽量缩短、宽度适当增大，且各通道间参数严格一致。在8通道芯片中，通道长度应不大于5mm，优选3mm宽度不小于0.5mm，优选1mm芯片功能区整体直径约为2.5cm。中心区的直径为4mm。

备注说明：由于芯片通道结构具有对称性，所以显色试剂从中心区处到达各样品检测区的距离或所需时间一致，从而可以保证检测中所有反应进程一致。对于8通道芯片，在同一个芯片上共有8个检测区，使用时，其中一个检测区用于空白样品对照；四个检测区用于不同浓度的标准样品的检测，用于半定量检测中作为颜色强度判定标准或在定量检测中以其灰度数据绘制工作曲线；剩余三个检测区用于待测样品的检测，可同时测定三个不同未知样品或对同一个样品进行三次平行测定。

作为本发明茶多酚含量快速检测芯片构型的进一步改进：所述亲水通道网络由中心区域和均匀地环绕中心区域的12条亲水通道，以及通道末端的12个反应检测区构成，用于同时进行更多数量的样品检测。

所述亲水通道网络的结构可以根据实际应用进行进一步设计、改变。

所述步骤(2)中，所述福林酚纸芯片制得后，应尽快进行检测，最好在2小时之内进行检测，不得长时间存放。

所述步骤(3)中，待测样品溶液为含有茶多酚的待测样品。

所述步骤(4)中，定量检测时，所述对显色后的芯片进行整体图片采集，优选采用扫描仪或者数码相机、智能手机等拍照，获得显色后的芯片图片；所述通过图像处理软件分析获得各检测区的颜色强度数据，所述图像处理软件优选为Photoshop、ImageJ等软件。

本发明的检测原理是：Na₂CO₃水溶液通过亲水通道从中心区流到各检测区，改变检测区pH值，从而激活福林酚试剂与茶多酚的显色反应，根据该显色反应所呈现蓝色的深浅可以进行茶多酚含量的半定量和定量测定。本发明利用芯片构型设计和芯片阵列反应，亲水通道的长度和宽度完全相等，从而使得(1)Na₂CO₃溶液到达所有检测区的时间完全一致，从而保证所有检测区中的显色反应同时开始，进行平行显色反应；(2)利用扫描、拍照等手段对所有检测区信号进行同时扫描，进行整体化的数据采集，获得反应时间高度一致的福林酚显色-检测阵列，从而可以在显色反应过程中的任意时间点实现准确的比色测定，在任意相同的显色反应时间点，标准溶液的颜色和待测样品的颜色均与浓度呈线性定量关系，因此不需要等待显色反应完全稳定，在反应持续动态进行的任意时间点，即可进行定量检测分析，解决了显色反应速率进度本身对检测过程的影响，消除检测时间对定量结果的影响，大大缩短了检测时间，实现茶多酚含量的快速检测。本发明方法一般在显色时间为1min～5min即可采集图片获取颜色强度数据，而常规方法每个显色反应均需要等待2小时以上才能检测吸光度。

与现行标准方法相比较，阵列化方法消除了反应动态进行阶段进行检测需要准确把握样品检测“时机”的必要性，即使在反应持续动态发生的显色初始阶段，亦可获得可靠的定量测定结果，使得检测可以在任意时间点进行，大大缩短茶多酚总量测定所需时间并简化了实验操作，实现多酚总量的快速测定。

本发明具有如下技术优势：

1.本方法测定溶液中多酚含量不受反应时间的影响，操作简单、检测快速；

2.测定过程不需要特殊设备，成本低，可随时随地检测；

3.本发明可以实现茶多酚含量的定量和半定量检测，且半定量检测不需借助任何检测设备，肉眼即可判定；

4.本发明推出一种新的检测手段和平台，采用廉价易得的纸芯片检测手段替换目前文献中报道的各种复杂昂贵的检测仪器，使得多酚含量检测可以实现实时、快速、现场检测。

综上所述，本发明旨在利用纸芯片具有的制备简单、易携带、试剂/试样消耗量低、可多元检测、操作简单、无需复杂昂贵的仪器设备等优点，提供一种简单、快捷、廉价、易携带的能够进行茶多酚含量快速检测的纸芯片方法。该方法能够快速地半定量或者定量地测定样品中茶多酚含量。

本发明提供一种以微流控纸芯片技术为基础的茶多酚快速检测方法。本方法将显色反应和光度法检测过程移植到微流控芯片中进行，利用微流控纸芯片的对称性多通道检测阵列，进行平行显色反应和整体化的数据采集，实现显色剂从芯片中心流动到达各检测点并与待测组分反应这整个过程在时间上的高度一致；再配合拍照或扫描等图像整体采集手段，从根本上实现批量、同步的平行反应操作，在福林酚-茶多酚反应的显色初始动态阶段，即可获得可靠的定量测定结果，大大缩短了检测所需时间；同时由于采用微流控芯片技术，试剂用量的大幅度减少，也显著降低了检测成本。

附图说明

图1具有对称性通道构型的微流控纸芯片结构示意图。

图2利用微流控纸芯片技术快速检测茶多酚含量的过程流程图。

图3不同显色时间条件下标准溶液显色信号响应图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方法做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

对称性通道构型的微流控纸芯片结构示意图如图1所示，

图1中，虚线方框代表芯片边缘；黑色实线条代表具有疏水性质的通道壁，黑色实线以外和虚线方框之间的部分全部为疏水区，包围黑色实现中间的对称性亲水通道网络。图1中，1～8所在圆形区域为反应检测区；与反应各检测区直接相连的条形区域为芯片亲水通道；各通道在芯片中央交汇，交汇点即为中心区，由记号O指示；各检测区到O点的距离均严格相等。通道的长度为3mm，宽度为1mm，反应检测区的直径为5mm，8条亲水通道环绕中心区，以中心区为对称点形成点对称。

图1为8通道芯片，使用时，其中一个检测区用于空白样品对照；四个检测区用于不同浓度的标准样品的检测，用于半定量检测中作为颜色强度判定标准或在定量检测中以其灰度数据绘制工作曲线；剩余三个检测区用于待测样品的检测，可同时测定三个不同未知样品或对同一个样品进行三次平行测定.

图2利用微流控纸芯片技术快速检测茶多酚含量的过程流程图。

图2中，A为具有对称性亲水通道网络的微流控纸芯片，对称性亲水通道网络由1～8的检测区和O标记的中心区以及连接检测区和中心区的亲水通道组成，由疏水区包围形成对称性亲水通道网络。

在A的8个检测区中滴加福林酚试剂，挥干后得到可用于茶多酚样品检测的纸芯片，如B所示。

在B的检测区滴加空白溶液、标准溶液和待测样品溶液，挥发至干，进样后的芯片如C所示；

在C的中心区滴加Na₂CO₃水溶液，如图中D所示，碳酸钠水溶液在纸纤维毛细管作用力的作用下通过亲水通道自然流动扩散至各检测区，如图中E所示，同步进行显色反应，如图中F所示，显色后的纸芯片图像如图中G所示。

茶汤中茶多酚含量(记为X₁)的半定量和定量快速测定：

1)溶液配制：待测样品为某绿茶按1：50的茶、水比冲泡的茶汤(记为X₁)，将原茶汤样品用去离子水稀释50倍后作为待测液；准备去离子水作为空白溶液；配制浓度为10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和75μg/ml的没食子酸水溶液作为标准溶液；用2N福林酚母液稀释7倍配制福林酚试剂，配制7.5％Na₂CO₃水溶液。

2)芯片准备：在米字形通道纸芯片的各个检测区内分别加入1.5μL福林酚试剂，空气中静置待水分挥干。

3)进样：在上述带有福林酚试剂的纸芯片的1号检测区内加入空白溶液、2～5号检测区内各加入标准溶液、6～8号检测区内加入待测液。所述各检测区内加入溶液的体积均为1.0μL。进样后的芯片在空气中放置待水分挥干。

4)反应：在上述进样后的纸芯片的中心区滴加30μL Na₂CO₃水溶液，在毛细管力的作用下，溶液分别从八个通道逐渐流动到检测区，激活显色反应。

5)浓度测定：

①半定量测定：显色反应约1min后，通过肉眼观测并对比，判定待测样品检测区的颜色强度大于25μg/ml、小于50μg/ml检测区的颜色强度，结合前述茶汤与待测液的浓度倍数关系，换算得到茶汤样品的茶多酚含量情况为：1.25mg/ml<X1<2.50mg/ml。

②定量测定：显色反应约3min后，将芯片置于扫描仪的原稿台上扫描，扫描存储为图片格式。在Photoshop软件中打开扫描所得图片，并依次读取各检测区的灰度数据，数据如下表1所示：

表1

表中1号检测区灰度数据代表芯片的灰度背景值，各检测区灰度扣除背景值后，为实际灰度信号。以2～5号实际灰度值为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标绘制工作曲线，线性拟合公式为y＝0.4352x+3.7375(R²＝0.9948)。将6～8号各实际灰度带入公式，计算得相应茶多酚浓度依次为29.54，26.31，27.19μg/ml，平均值为27.68μg/ml。检测结果与常规分光光度法检测结果(29.84μg/ml)具有良好的一致性。

结合茶汤与检测样品之间的稀释倍数，实际测得原待测茶汤中茶多酚浓度X₁＝1.38mg/ml。

实施例2

为了检验本发明检测方法的可靠性及其检测结果与显色反应进程的无关性特点，发明人在发明过程中还对显色反应时间等条件进行了考察，具体实验如下：

条件筛选实验1：分别配置浓度为0μg/ml，10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，75μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/m的没食子酸水溶液，在同一片8通道芯片中，进行上述水溶液的在不同显色反应时间条件下的信号扫描测定，分别在显色反应开始后的1min，2min，3min，5min，8min，10min，12min，15min，18min，20min，25min，30min，60min，90min测定灰度值并绘制工作曲线。扣除空白检测区灰度值后的实际灰度信号结果如图3所示。实验结果显示：1)显色反应1min后，检测信号已显示出良好的线性，可用于进行定量测定；2)由于空白检测区颜色在空气中会缓慢加深，同一检测区的信号值随着反应时间的增加有逐步减小的趋势，但检测信号在显色反应开始的10min内信号基本稳定，且该时间段内任意时间所测数据在10～200μg/ml范围内均显示出良好的线性，均适宜于定量检测应用；但是随着时间的进一步增加，尤其是显色进行20min后，各检测区的灰度信号值(特别是高浓度样品的信号值)有较为明显的降低，这直接导致了方法检测灵敏度的降低及线性范围的缩小，故为非最佳检测条件。以75μg/ml标准溶液作为待测溶液模拟定量检测，在1min，3min，5min时所测得的浓度值分别为77.59μg/ml，80.59μg/ml和83.45μg/ml检测误差分别占真实浓度的3.5％，7.5％，和11.3％。

综合上述实验结果并结合实际检测需求，显色反应开始后的1～10min可实现准确定量测定，显色反应开始后1～5min为检测的最佳时间窗口。

实施例3

本发明所建立的方法不仅可用于测定茶多酚的水溶液，对于含有机溶剂的茶多酚溶液同样可以实现快速测定。为检验这一点，发明人按照中国家标准规定的茶叶中茶多酚提取方法(GB/T 8313-2008)制备茶多酚的甲醇提取液，该溶液稀释50倍后，在稀释液中加入20μg/ml浓度的没食子酸标准物，进行回收率测定实验。

按照实施例1方法操作，显色3min进行检测，使用3片不同芯片测得的没食子酸加入量分别为21.6μg/ml，16.2μg/ml和19.4μg/ml，对应的检测回收率数值分别为108％，81％和92％，显示出该方法具有良好的可靠性。

需要指出的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。