本发明属于细菌微生物检测技术领域,具体涉及一种对金黄色葡萄球菌IV种AIPs信号分子同时进行检测的液质联用检测方法。
背景技术:
随着科学技术的发展,质谱技术在食品安全检测中发挥着越来越大的作用,液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)具有传统方法无法比拟的优势,既发挥了现代色谱对复杂样品的高分离能力,又应用了质谱的高选择性、高灵敏度以及能够准确提供化合物的分子量与结构信息的优点。在食品研究领域,液-质联用技术不仅能够灵敏的检测出食物中药物的残留和添加剂由于加工过程发生化学变化所产生的有害物质,还可以用来检测微生物自身分泌的生物毒素等。有研究报道,冯峰等利用液相色谱串联二级质谱技术在葡萄酒中检测出了14种违规的食品添加剂,他所建立的方法检测限在0.01~1.0μg/mL,回收率达到93.8%~106%。
近年来人们发现,细菌在增殖过程中能产生某些可以作为化学信号在细菌细胞间传递信息的物质,当这种信号分子的浓度达到一定的阈值浓度时,它能够激活或抑制一些目的基因的表达,从而对细菌的生理学功能进行调控。这种细菌之间通过信号分子交流来共同完成一些重要的生理功能的现象称为群体感应效应(quorum sensing,Qs)(Miller),AIPs信号分子是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)在群体感应系统中起到传递信息的一类物质,是一种自诱导肽,根据编码的不同包括四种结构形式,分别为AIP-I、AIP-II、AIP-III、AIP-IV,如图1所示;Hiyas等的研究是利用UHPLC技术对S.aureus所产生的AIP-I信号分子进行检测,检测限达到0.25μM,然而,Hiyas所用的菌株并非是来源于中国的食物中毒菌株,且其仅研究了AIP-I号分子的检测方法,是不足以满足对金黄色葡萄球菌群体感应系统的研究,并且,本申请的发明人发现同一株金黄色葡萄球菌在整个生长过程中只能产生一种AIP信号分子,要研究不同菌株的群体感应必须建立一种可以同时检测四种AIPs分子的方法;此外,S.aureus所产生的AIPs信号分子,在群体感应中起着调控菌体之间互相感知并产生生理功能和生物毒素的作用,在一定程度上调控着金黄色葡萄球菌肠毒素和生物膜的产生,而肠毒素和生物膜是给食品微生物安全带来隐患的主要原因,因此建立一种快速及时并能对IV种AIPs分子同时进行检测的方法,来实现早期对毒素和生物膜的产生进行检测是十分必要。
技术实现要素:
为了克服上述背景技术中所述的现有的对S.aureus所产生的AIPs信号分子进行检测的缺陷,实现早期对毒素和生物膜的产生进行检测,保证食品微生物安全,本发明提出了一种对金黄色葡萄球菌IV种AIPs信号分子同时进行检测的液质联用检测方法。
本发明的液质联用检测方法的具体技术方案在于:
本发明要求保护一种金黄色葡萄球菌IV种AIPs信号分子同时进行检测的液质联用检测方法,其特征在于,
包括以下步骤:
(1)标准工作液的配制
a.按照1:1~1:1.5的体积比将乙腈溶液和含0.1~0.15%甲酸的水溶液均匀混合,作为溶剂用;
b.分别准确称取一定量的IV种AIPs分子标准品,放入同一容量瓶中并使用上述溶剂进行定容,使得溶液中各单质的质量浓度为10mg/mL,4℃避光贮存备用;在实验前按照梯度稀释的方法,用所述溶剂作为稀释液对存储液进行稀释,得到浓度分别为4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的溶液作为标准工作液;
(2)液质联用检测方法的建立
使用步骤(1)所配置的标准工作液,进行液质联用检测方法的建立,根据得到的AIPs分子的色谱峰图,确定液相色谱和质谱条件如下:
a.液相色谱条件:水相为含体积比0.1~0.2%甲酸的水溶液;有机相为含体积比0.1%~0.2%甲酸的乙腈溶液;色谱柱型号:SHIM-PACK XR-ODS 3.0mm×75mm,2.2μm;进样量:10~30μL;柱温:30℃;流速:0.3mL/min;采用梯度洗脱的方式,在10~13min内,水相从80%变化到30%;
b.质谱条件:在电喷雾电离正离子检测模式下(ESI+),采用多反应监测的质谱扫描模式(MRM);离子源温度为500℃;电喷雾电压为4400V;气帘气压力为10psi;雾化气压力为50psi;同时监测了IV种目标物,其中IV种AIPs信号分子的保留时间均在4.60min~6.60min之间;去簇电压在130~150V之间;射入电压在8~11V之间;碰撞电压在40~45V之间;碰撞室电压在18~20V之间。
本发明液质联用检测方法的优选的技术方案是,所述步骤(2)中的液相色谱条件中:水相为含体积比0.1%甲酸的水溶液;有机相为含体积比0.1%甲酸的乙腈溶液。
本发明液质联用检测方法的进一步优选的技术方案是,所述步骤(2)建立的液质联用检测方法对金黄色葡萄球菌IV种AIPs分子同时进行检测可达到的最低检测限范围是0.001mg/L~0.006mg/L。
另外,本发明还提供了一种对其金黄色葡萄球菌IV种AIPs信号分子同时进行检测的液质联用检测方法的应用,其用于对细菌发酵液中的AIPs分子的检测。
优选地,其中,细菌发酵液中AIPs分子的提取采用下述8种抽提方法任一方法进行提取,该所述的抽提方法具体为a1~a8所述:
a1:向发酵液中加入适量甲酸,使混合液的pH值为2.5,混合均匀后静置10min,而后低速离心4000rpm/min离心5min,去掉菌体取上清液进行过滤,滤液装入2mL的进样瓶中等待测定;
a2:向发酵液中加入0.1%的吐温80,同样静置10min后离心过滤待测;
a3:发酵液装入玻璃管中超声提取10s后无需等待即可低速离心去菌体后过滤待测;
a4:用甲酸将发酵液的pH调到2.5后,加入0.1%的吐温80,混合均匀静置10min后离心过滤;
a5:用甲酸将发酵液的pH调到2.5以后,超声波处理10s后离心过滤;
a6:向发酵液中加入0.1%的吐温80并混合均匀后进行10s的超声波处理,后离心过滤;
a7:向发酵液中加入0.1%的吐温80并用甲酸溶液将pH调到2.5后,超声处理10s再进行离心过滤;
a8:发酵液不经过任何处理,直接用低速离心机去菌体后取上清过滤。
进一步优选地,所述AIPs分子的8种抽提方法中优选采用a8方法,即发酵液不经过任何处理,直接用低速离心机去菌体后取上清过滤。
更进一步优选地,其中细菌发酵液中AIPs分子的提取时间为:在转速为180~200rpm/min的培养条件下,第12~20h进行提取。
最进一步优选地,上述的提取时间为第12h。
本发明的有益效果:本发明建立了金黄色葡萄球菌IV种AIPs信号分子同时进行检测的液质联用检测方法。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确且样品的前处理方法简便易操作,避免了二次污染,提高了检测的准确度,使用该方法可以在10min内完成对金黄色葡萄球菌IV种AIPs信号分子的分离与检测。本发明的方法的IV种AIPs信号分子在0.1~4.0mg/L范围内均具有较好的线性关系,相关系数大于0.996。在0.2mg/L、1.0mg/L和2.0mg/L的添加水平下,实际样品中IV种AIPs信号分子的回收率在65.7%~122.3%之间,相对标准偏差(RSD,n=6)在1.2%~13.7%之间,方法的最低检测限达到0.001mg/L,可以满足对金黄色葡萄球菌IV种AIPs信号分子的定性与定量分析,为食品安全监测提供一种可靠的检测方法。
附图说明
图1为金黄色葡萄球菌AIPs信号分子的四种不同结构形式;
图2为四种AIPs分子标准品在正离子模式下的色谱图;
图3为四种AIPs分子样品在正离子模式下的色谱图;
图4为不同抽提方法下提取的AIPs分子的产量;
图5为不同提取时间下提取的AIPs分子的产量。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好的理解本发明。
1.材料
方法学研究实验的样本来自于本实验室前期调查的金黄色葡萄球菌样本。
(1)仪器:本实施例所用仪器详见表1。
表1仪器设备表
(2)试剂耗材:乙腈(色谱纯)、甲酸、吐温80购自天津市科密欧化学试剂有限公司;胰蛋白大豆琼脂(TSA)和胰蛋白大豆肉汤(TSB)购自北京陆桥技术责任有限公司;氯化钠、葡萄糖、蔗糖、氢氧化钠均购自西安化学试剂厂。液相色谱进样瓶(2mL)和注射器(3mL)购自陕西杨凌小白试剂公司;醋酸纤维素一次性针头滤器(0.2μm,赛多利斯)购自西安热默尔生物公司。
(3)标准品:本实施例中四种金黄色葡萄球菌群体感应信号分子(AIPs)标准品均由上海科肽生物技术有限公司合成,纯度≥90%。
2.方法
本发明提出的对IV种金黄色葡萄球菌AIPs信号分子的液质联用检测方法如下:
(1)标准工作液的配制
a.按照1:1的体积比将乙腈溶液和含0.1%甲酸的水溶液均匀混合,作为溶剂用;
b.分别准确称取一定量的IV种AIPs分子标准品,放入同一容量瓶中并使用上述溶剂进行定容,使得溶液中各单质的质量浓度为10mg/mL,4℃避光贮存备用;在实验前按照梯度稀释的方法,用所述溶剂作为稀释液对存储液进行稀释,得到浓度分别为4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的溶液作为标准工作液;
(2)液质联用检测方法的建立
使用步骤(1)所配置的标准工作液,进行液质联用检测方法的建立,根据得到的AIPs分子的色谱峰图,确定液相色谱和质谱条件如下:
a.液相色谱条件:水相为含体积比0.1%甲酸的水溶液;有机相为含体积比0.1%甲酸的乙腈溶液;色谱柱型号:SHIM-PACK XR-ODS 3.0mm×75mm,2.2μm;进样量:10μL;柱温:30℃;流速:0.3mL/min;采用梯度洗脱的方式;梯度洗脱程序详见表2。
表2流动相及梯度洗脱条件
为了增加峰的强度,优选使用含0.1%甲酸的乙腈溶液作为有机相;含0.1%甲酸的水溶液作为水相,而后确定了0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液流动相体系的最佳洗脱比,在这一洗脱程序下,IV种信号分子均可获得较好的分离和峰形;
b.质谱条件:在电喷雾电离正离子检测模式下(ESI+),采用多反应监测的质谱扫描模式(MRM);离子源温度为500℃;电喷雾电压为4400V;气帘气压力为10psi;雾化气压力为50psi;检测方式:多反应监测(MRM);以多反应监测(MRM)方式优化各种质谱参数,其中优化得到色谱、质谱条件见表3。
表3不同样品的最优化MS/MS参数
注:DP:去簇电压;EP:射入电压;CE:碰撞电压;CXP:碰撞室射出电压;
多反应监测模式下四种AIPs信号分子所测得的标准品和样品的峰图如图2和图3所示,其中,A表示AIP-II号分子,分子量是879.7;B表示AIP-I号分子,分子量是961.5;C表示AIP-III号分子,分子量是819.6;D表示AIP-IV号分子,分子量是1009.7。
进一步,对上述建立的金黄色葡萄球菌IV种AIPs信号分子同时进行检测的液质联用检测方法进行应用,使其用于对细菌发酵液中的AIPs分子的检测。
在此,本申请的发明人针对不同的提取方法还选用了三株不同的菌株来进行测验,每个抽提方法做三个实验平行,来分析不同的抽提方法对AIPs分子的回收率的影响(结果如图4所示),其试验表明,不同的抽提条件对AIPs分子的回收率影响并不显著,因此,本研究的后续优选将采用第八种(即a8)方法,即直接对发酵液进行离心过滤回收,以提高效率;细菌发酵液中AIPs分子的提取采用下述8种抽提方法任一方法进行提取:
a1:向发酵液中加入适量甲酸,使混合液的pH值为2.5,混合均匀后静置10min,而后低速离心4000rpm/min离心5min,去掉菌体取上清液进行过滤,滤液装入2mL的进样瓶中等待测定;
a2:向发酵液中加入0.1%的吐温80,同样静置10min后离心过滤待测;
a3:发酵液装入玻璃管中超声提取10s后无需等待即可低速离心去菌体后过滤待测;
a4:用甲酸将发酵液的pH调到2.5后,加入0.1%的吐温80,混合均匀静置10min后离心过滤;
a5:用甲酸将发酵液的pH调到2.5以后,超声波处理10s后离心过滤;
a6:向发酵液中加入0.1%的吐温80并混合均匀后进行10s的超声波处理,后离心过滤;
a7:向发酵液中加入0.1%的吐温80并用甲酸溶液将pH调到2.5后,超声处理10s再进行离心过滤;
a8:发酵液不经过任何处理,直接用低速离心机去菌体后取上清过滤;
对于提取时间的选择,在转速为180~200rpm/min的培养条件下,选择第12h、16h和20h三个时间点进行抽样测定;在此本申请的发明人针对该不同的提取时间选取了15株菌株进行测试(结果如图5所示),其结果发现所试的15株菌株均是在第12h时抽提出的AIPs分子量最多,并且根据时间的增加呈下降趋势,到第20h时量最少,为此,本发明优选在培养至第12h时进行抽提。
3.方法验证
(1)标准品和样品的色谱图
IV种AIPs信号分子的标准品和金黄色葡萄球菌发酵样品的峰形比较对称,除了样品中AIP-IV号分子无法良好检测之外,其他峰形较好,无杂峰干扰,说明在此条件下能够得到良好的检测,图2为IV种AIPs信号分子标准品的色谱图,图3为样品中IV种AIPs信号分子的色谱图,可以发现LC-MS/MS的检测足以满足定量要求。
(2)校准曲线
将配置好的标准工作液在上述方法下进行检测;其中,每组溶液分别进样10μL,以目标分析物的质谱信号峰面积(y)对质量浓度(x)做标准曲线,得到四种AIPs信号分子的线性方程和线性相关系数;并且得到检测限和定量限。IV种AIPs信号分子在各自浓度范围内的线性拟合方程,线性良好,相关系数在0.996以上,检测限在0.001mg/L~0.006mg/L之间,满足定量要求,见表4。
表4线性关系、检测限和定量限
(3)精密度与回收率试验
最后,为了对本发明所建立的对IV种AIPs分子同时进行检测的方法进行验证,本申请的发明人以126号S.aureus菌株为试验菌株进行精密度和回收率实验,以验证该方法的可行性,经过测定得知此菌株可以产生AIP-I号分子,目标分析物的加标水平分别为0.2mg/L、1.0mg/L和2.0mg/L,每一组浓度重复6次,每一种AIPs信号分子所测得的相对标准偏差(RSD)和回收率各不相同,其中AIP-I号分子的RSD为2.7%~7.4%,回收率为65.7%~81.9%;AIP-II号分子的RSD为2.2%~7.3%,回收率为89.1%~105.4%;AIP-III号分子的RSD为1.2%~5.0%,回收率为86.3%~114.8%;AIP-IV号分子的RSD为3.0%~13.7%,回收率为117.8%~122.3%,详见表5。
表5相对标准偏差(RSD)和加标回收率
本发明通过对金黄色葡萄球菌细菌培养液中AIPs分子的提取研究,建立了高效液相色谱-串联质谱联用法定量分析了IV种AIPs分子的快速检测方法,样品的前处理方法简便易操作,避免了二次污染,提高了检测的准确度,本发明的方法的最低检测限达到0.001mg/L,回收率最高可达到122.3%,并且精密度和线性范围均达到检测的要求,可以满足后续实验的需要,为食品安全监测建立了基础。
另外,还需要说明的是,以上所述仅为本发明的具体地实施方式或优选的实施方式,并非因此限制本发明的专利范围,凡是本领域技术人员利用本申请文件的记载所作的等效结构或等效变化,或直接或间接应用在其它相关的技术领域,其均同理包括在本发明专利申请的保护范围内。