快速检测和预警食源性毒素污染的流动注射发光细菌法及应用的制作方法

本发明属于食品安全和环境监测及公共安全领域，具体涉及一种快速检测和预警食源性毒素污染的流动注射发光细菌法及应用。

背景技术：

近年来发生的突发性引用水污染事件中，人为饮用水投毒难以被及时发现，某些常见的食源性毒素毒性强而且简单易得，很容易被不法分子利用，因此建立饮用水中食源性毒素快速检测和预警系统具有重要意义。

化学分析法可对水环境中污染物进行定性与定量分析，却不能直接反映污染物对环境和生物的影响。以发光细菌为受试生物的毒性测试法，因快速、简便、灵敏、稳定、经济而受到关注大量实验表明，发光细菌毒性实验与鱼类毒性实验对化合物毒性评价上有良好的相关性。发光菌对环境中的毒物反应灵敏，表现在接触毒物后发光强度能迅速受到抑制。我国特有的淡水发光菌青海弧菌Q67(Vibrioqinghaiensis sp.Q67)有以下特点：(1)它不需要NaCl存在也能良好发光(即可在淡水体系中进行正常生长和发光)；(2)适应温度范围广；(3)pH值在较大范围内均能生长和发光；(4)对金鱼的感染试验表明它为非致病菌。对于一般淡水水体或污染物的监测青海弧菌有其独特的优点。近年青海弧菌受到广泛关注，但与之相配的方法尚不统一，多采用细菌冻干粉复苏发光后直接检测水质毒性。而采用细菌冻干粉复苏途径存在以下问题：一是冻干粉制作成本较高；二是复苏率差异会影响检测结果；三是不能在常温下携运。以上特点限制了其推广应用。

技术实现要素：

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种快速检测和预警食源性毒素污染的流动注射发光细菌法。

本发明的另一目的在于提供上述快速检测和预警食源性毒素污染的流动注射发光细菌法的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种快速检测和预警食源性毒素污染的流动注射发光细菌法，包括如下步骤：

(1)青海弧菌Q67菌剂复苏、接种和连续培养；

(2)流动注射系统程序设计；

(3)流动注射发光细菌法检测样品溶液；

(4)数据集成和处理及报警系统的设计。

优选的，所述快速检测和预警食源性毒素污染的流动注射发光细菌法的具体步骤如下：

(1)青海弧菌Q67菌剂复苏、接种和连续培养：取-20℃青海弧菌Q67冻干粉安瓿1支，消毒、4℃预冷15min后，加入复苏液轻微振荡，于超净工作台内接种1000μL菌悬液至1000mL液体培养基中，25℃、120rpm振荡培养16h至最佳发光状态，得到测试用菌液并转移至连续培养发酵罐进行连续培养；

(2)流动注射系统程序设计：流动注射进样器程序设定如表1；

表1设定流动注射进样器程序

(3)流动注射发光细菌法检测：将步骤(1)连续培养的测试用菌液通过流动注射进样器泵入超微弱发光检测系统，以超纯水作为空白对照，得到稳定的发光信号后，导入待测样品溶液进行发光检测得到相应的发光强度；

(4)数据集成和处理及报警系统的设计：数据集成和处理及报警系统由依次连接的光电倍增管、光电转换及电压放大模块、模数转换模块、定量检测模块和报警器组成；步骤(3)检测得到的光信号经光电倍增管放大以后，通过光电转换及电压放大模块，再经过模数转换模块得到数字信号，经定量检测模块得到相对发光强度；相对发光强度＝(样品发光强度/对照发光强度)×100％，当定量检测模块检测到相对发光强度小于80％时触发报警器报警。

优选的，步骤(1)所述液体培养基按以下步骤配制并进行灭菌处理后转移至补料储液罐中：称取胰蛋白胨5g、酵母粉5g、NaCl 6.73g、Na₂CO₃ 0.99g、NaHCO₃ 0.57g、MgCl₂·6H₂O 2.92g、MgSO₄ 2.47g、CaCO₃ 0.03g、NaBr 0.1g、以及KCl 0.22g，逐一加入1L的三角烧瓶中，加甘油3mL，加蒸馏水1000mL，混匀过滤去沉淀，用牛皮纸包扎后121℃灭菌15min。

优选的，步骤(3)所述样品溶液为含有3-硝基丙酸或含有秋水仙碱的水溶液。

优选的，步骤(3)所述样品溶液为饮用水、食品加工企业的水源、甘蔗样品溶液或新鲜黄花菜样品溶液。

优选的，步骤(3)所述样品溶液为饮用水时，步骤(4)中相对发光强度在80％以下则表明饮用水可能受到污染，经定量检测模块分析后触发报警器报警。

更优选的，所述甘蔗样品溶液或新鲜黄花菜样品溶液可通过以下步骤制得：称取10g甘蔗或新鲜黄花菜进行前处理后，通过超声提取15min，定量滤纸过滤，滤液经5000rpm高速离心后用0.2μm孔滤膜过滤备用。

更优选的，所述甘蔗前处理是指将待测样品去皮切碎后挤压得到样品液；所述新鲜黄花菜前处理是指用均质仪粉碎。

优选的，步骤(3)所述检测过程中，测试用菌液和样品溶液需要提前预混合然后由磷酸缓冲液载入超微弱发光检测系统进行检测。

更优选的，步骤(3)所述样品溶液与测试用菌液在检测过程中混合时间为10s，检测时间为60s。相比于其他检测方法极大地缩短了检测时间，适用于突发性污染的快速检测。

优选的，步骤(3)所述检测过程中，测试用菌液补料速度根据流动注射系统检测速度调整以保证菌液始终保持相对恒定的发光强度。

上述快速检测和预警食源性毒素污染的流动注射发光细菌法可用于食品加工企业的水源污染监控、饮用水在线监控、以及饮用水中突发性食源性毒素污染检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)化学分析法可对水环境中污染物进行定性与定量分析，却不能直接反映污染物对环境和生物的影响。目前对于食源性毒素如3-硝基丙酸、秋水仙碱的检测方法多为薄层色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法、高效液相色谱法、固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法等。这些方法存在需使用大量毒性大的有机试剂、操作复杂，检测周期长等缺点，仅仅能应用于实验室检测，而不能应用于生产生活中。与上述方法比较，本发明流动注射发光细菌法由于操作简单，灵敏度高，能实现连续进样进行在线监测，能被广泛用于食品加工，环境监测和公共安全等领域。

(2)本发明所建立的流动注射发光细菌法检测和预警食源性毒素污染，分析速度快、操作简便、自动化程度高，避免了手工操作引起的误差，重现性好，由于采用流动注射分析法和发光细菌连续培养相结合，受到的交叉污染可能性很低。同时，利用青海弧菌作为测定污染毒素的指示剂，检测范围广、反应灵敏。

因此，可以根据不同的检测需求，应用到环境水资源的污染监控，突发性饮用水的食源性毒素污染，或者以通过优化和改进用于食品加工企业各生产环节的水源污染监控。这样的连续在线监测体系，不仅能够根据实际需要调整流动注射系统的程序和连续培养装置的控制来实现实时检测和重点时段和环节的监测，而且能够对特定的污染物进行有选择性的重点监测，对于企业生产环节的监控和突发性饮用水污染的预警监控都有很广泛的应用前景和实用价值；能够在第一时间对饮用水大规模突发性食源性毒素污染进行预警和响应、能够有效预防此类公共安全危害。

(3)目前一般采用细菌冻干粉复苏发光后直接检测水质毒性。而采用细菌冻干粉复苏途径存在以下问题：一是冻干粉制作成本较高；二是复苏率差异会影响检测结果；三是不能在常温下携运。以上特点限制了其推广应用。

本发明从淡水发光菌生长发光规律着手，采用新鲜连续培养的发光菌，结合流动注射发光法对水中食源性急性毒性进行了研究，利用对数期生长发光良好的新鲜菌液进行实验检测有效解决了冻干粉制作成本高、复苏率差异对实验和技术推广的限制，以期为饮用水食源性毒素突发性污染提供检测依据。

(4)流动注射分析(FIA)是在热力学非平衡条件下，通过载流驱动重现技术来处理试样或试剂区带的动态定量分析技术，具有分析速度快、准确度和精密度好、自动化程度高以及可与多种检测手段相结合等优点。本发明将流动注射的方法与发光细菌法结合起来，能实现快速在线监测饮用水中的毒素；且流动注射发光细菌检测法，发光细菌和污染毒素接触时间短有效克服了青海弧菌Q67菌株的稳定发光时间有限的问题，结果更加科学可信。

附图说明

图1为流动注射发光细菌快速检测和预警食源性毒素方法的步骤流程图。

图2为快速检测和预警食源性毒素污染的流动注射发光细菌法的装置图，其中：1-补料储液罐、2-空气过滤装置、3-进气导管、4-蠕动泵、5-培养发酵罐、6-水浴恒温振荡器、8-缓冲液槽、7-样品溶液槽、9-蠕动泵、10-混合管、11-六通阀、12-废液池、13-流通池、14-负高压、15-光电倍增管、16-计算机、17-报警器。

图3为液体培养基pH对发光细菌生长的影响。

图4为液体培养基温度对发光细菌生长的影响。

图5为不同浓度3-硝基丙酸对发光细菌相对发光强度的影响。

图6为不同浓度秋水仙碱对发光细菌相对发光强度的影响。

图7为数据集成和处理及报警系统示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明一种快速检测和预警食源性毒素污染的流动注射发光细菌法包括如下步骤：青海弧菌Q67菌剂复苏、接种和连续培养；流动注射系统程序设计；流动注射发光细菌法检测样品溶液；数据集成和处理及报警系统的设计。该方法将制备好的青海弧菌Q67液体培养基经补料储液罐泵入菌体发酵培养罐(由于青海弧菌是好氧菌，整个连续培养过程都有无菌空气泵入)，经过相对发光强度来判断是否存在食源性毒素污染及毒性的大小。

用于实现本发明快速检测和预警食源性毒素污染的流动注射发光细菌法的装置如图2所示，它包括发光细菌连续培养系统、加样系统、超微弱发光检测系统、数据集成和处理及报警系统；发光细菌连续培养系统由补料储液罐1、空气过滤装置2、蠕动泵4、进气导管3、培养发酵罐5和水浴恒温振荡器6组成，进气导管3、空气过滤装置2、补料储液罐1、蠕动泵4、培养发酵罐5依次相连通，培养发酵罐5置于水浴恒温振荡器6中；加样系统为流动注射进样器，包括样品溶液槽7、蠕动泵9、缓冲液槽8、混合管10、六通阀11、废液池12和流通池13，样品溶液槽7、缓冲液槽8、培养发酵罐5分别与混合管10连通，通过蠕动泵9控制测试用菌液、缓冲液、样品溶液的流加速度，通过六通阀11来控制试用菌液样品溶液和缓冲液的混合顺序，混合管10、废液池12和流通池13连通；超微弱发光检测系统包括超微弱发光检测仪和负高压14；培养发酵罐5通过软管与流动注射进样器相连通；数据集成和处理及报警系统由光电倍增管15、计算机16和报警器17组成。计算机16是指光电转换及电压放大模块、模数转换模块、以及定量检测模块设置是计算机设定的检测程序，在得到数字信号之后，经过所编写的计算机程序来进行定量检测。

以下实施例为本发明流动注射发光细菌法在几种食源性毒素样品检测中的应用。实施例中使用的青海弧菌Q67冻干粉购于滨松光子学商贸(中国)有限公司；超微弱发光检测仪采用北京亚泊斯科技有限公司的BPCL-K型微弱发光测量仪；流动注射进样器采用西安瑞迈分析仪器有限责任公司的IFIS–C型智能流动注射进样器，具有程序控制调节载流液流速以及微量进样的功能。

实施例1

食源性毒素3-硝基丙酸、秋水仙碱的检测实例，具体步骤流程如图1所示，包括菌剂的复苏和培养基的准备，测试菌液的制备，毒素样品的准备，发光检测，相对法强度的计算和分析，预警系统的响应。具体步骤如下：

(1)配制毒素储备液并对储备液进行适当稀释得到所需毒素样品浓度：

3-硝基丙酸储备液(500mg/L)：称取0.05g 3-硝基丙酸(Sigma公司)，用少量屈臣氏蒸馏水溶解，定容至100mL容量瓶中储存备用。按照实验需要稀释储备液分别得到100、80、60、40、20、10mg/L的3-硝基丙酸溶液备用。

秋水仙碱储备液(500mg/L)：称取0.05g秋水仙碱(Sigma公司)，按照实验需要稀释储备液分别得到10、8、6、4、2、1mg/L的秋水仙碱溶液备用。

(2)配制甘蔗样品溶液和新鲜黄花菜样品溶液：

称取去皮后切碎挤压得到的发红甘蔗样品和新鲜黄花菜样品各10g，分别加水定容至100mL。超声提取15min，定量滤纸过滤，取滤液经5000rpm高速离心后用0.2μm微孔滤膜过滤备用。所得甘蔗样品溶液或新鲜黄花菜样品溶液与标准溶液(即3-硝基丙酸溶液、秋水仙碱溶液)在同一条件下测定。

(3)配制青海弧菌Q67液体培养基：

用电子天平称取胰蛋白胨5g、酵母粉5g、NaCl 6.73g、Na₂CO₃ 0.99g、NaHCO₃0.57g、MgCl₂·6H₂O 2.92g、MgSO₄ 2.47g、CaCO₃ 0.03g、NaBr 0.1g、以及KCl 0.22g，逐一加入1L的三角烧瓶中，加甘油3mL，加蒸馏水1000mL，混匀过滤去沉淀，用牛皮纸包扎后121℃灭菌15min。冷却后使用或放置于4℃冰箱保存备用。

(4)青海弧菌Q67菌剂复苏及接种、连续培养：

取4℃青海弧菌Q67冻干粉安瓿1支，酒精棉球擦拭外周消毒后，超净工作台内砂轮切开小口，缓慢开启安瓿，4℃预冷15min的0.9％NaCl 1mL加入开启的安瓿中，轻微振荡，于超净工作台内接种1000μL菌悬液至1000mL液体培养基中，25℃、120rpm振荡培养16h至最佳发光状态，得到测试用菌液。

(5)pH对青海弧菌Q67生长的影响：

灭菌之前将步骤(3)配制的液体培养基按每瓶100mL分装至7个250mL培养瓶中，以0.1mol/L NaOH溶液和0.1mol/L HCl溶液调pH值分别得到pH为6、6.5、7、7.5、8、8.5、9的液体培养基，于超净工作台内接种100μL对数期菌悬液至100mL液体培养基中，25℃、120rpm振荡培养16h至最佳发光状态，分别测试其OD值和发光强度值。实验结果如图3所示，培养基的pH对青海弧菌Q67的生长有较大影响，青海弧菌Q67在pH为8的培养液中生长状况和发光强度最佳，而对于所配制的培养基的pH在7.95左右，因此配制培养基时不需进行pH的调节。

(6)温度对青海弧菌Q67生长的影响：

灭菌之前将步骤(3)配制的液体培养基按每瓶100mL分装至5个250mL培养瓶中，于超净工作台内接种100μL对数期菌悬液至100mL液体培养基中，分别放置于15、20、25、30、35℃，120rpm振荡培养16h至最佳发光状态，分别测试其OD值和发光强度值。实验结果如图4所示，25℃时青海弧菌的生长状况最好，因此选择振荡培养时保持水浴温度在25℃。

(7)菌液发光强度测定：

设定负高压为800V，取16小时培养后的菌液2mL静置5min后于超微弱发光检测仪上测定发光值。菌液发光强度在1.0×10⁵左右即可作为测试用菌液。

(8)流动注射系统程序设计：设定智能流动注射进样器程序如表1所示。

(9)流动注射发光细菌法检测：

将步骤(4)连续培养的测试用菌液通过流动注射进样器，以pH为6.5的磷酸缓冲液作为载流泵入超微弱发光检测系统，以超纯水作为空白对照，得到稳定的发光信号后，依次泵入步骤(1)配制的不同浓度的3-硝基丙酸溶液、秋水仙碱溶液、甘蔗样品溶液或新鲜黄花菜样品溶液；上述溶液先和测试用菌液进行预混合，再经过载流泵入超微弱发光检测系统进行发光检测得到相应的发光强度。

(10)数据集成和处理及报警系统的设计：数据集成和处理及报警系统系统如图7所示，由依次连接的光电倍增管、光电转换及电压放大模块、模数转换模块、定量检测模块和报警器组成；步骤(9)检测得到的光信号经光电倍增管放大以后，通过光电转换电压放大，在经过模数转换得到数字信号，经定量检测模块得到相对发光强度。相对发光强度＝(样品发光强度/对照发光强度)×100％，当定量检测模块检测到相对发光强度小于80％时触发报警器报警。

3-硝基丙酸流动注射发光细菌法检测结果如图5所示：3-硝基丙酸的最低预警浓度(相对发光强度为80％)为25.4mg/L。发红的甘蔗样品中3-硝基丙酸的浓度为36.3mg/L，在预警范围内。

秋水仙碱流动注射发光细菌法检测结果如图6所示：秋水仙碱的最低预警浓度(相对发光强度为80％)为2.7mg/L，新鲜黄花菜样品中检测到的秋水仙碱浓度为3.4mg/L在预警范围内。因此本发明流动注射发光细菌检测法可以用于饮用水中突发性食源性毒素的污染。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。