牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡及其制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡及其制备方法。

背景技术：

牛结核病是由牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病的人畜共患传染病。会对奶牛业和人畜的健康造成严重危害。

牛布鲁氏病是由牛种布鲁氏菌(B.abortus)引起的一种人畜共患慢性细菌性传染病。受感染的动物和人往往会导致生殖系统的损害，对人类的身心健康造成严重的威胁和对畜牧业造成巨大的经济损失。

检测牛血清中牛结核杆菌或布鲁氏杆菌抗体是目前对牛结核病或牛布病免疫学血清诊断方法之一。中国专利CN200910218156.6和CN200610166551分别采用不同的牛结核杆菌蛋白抗原，用免疫胶体金卡条技术检测牛血清中的抗体。但这两种免疫胶体金卡只检测牛结核杆菌抗体。

牛布病免疫学血清诊断方法有凝集试验、补体结合试验、ELISA、荧光偏振试验、乳环试验等。这些方法或需要特殊的仪器设备和专业人员操作，费时。而且用一种方法来检测时容易出现非特异性结果。 中国专利CN201410266781.9，CN200910071636.4，CN200910071637.9和CN201110031816.7均为基于ELISA的检测方法，需要酶标仪和专业人员操作，耗时较长，相应的方法只能检测一种抗体。

综上所述，牛结核病和牛布病都是商品肉牛和奶牛常见而且危害严重的疾病。目前在对牛结核和牛布病免疫血清学抗体检测领域的一些检测方法都是只针对一种疾病的检测。

技术实现要素：

本发明的第一目个的是提供一种同时检测牛血清中牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌的胶体金双联检测卡及其制备方法，该检测卡可同时检测牛血清标本中的牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌，其检测时间短、稳定性好、操作简单、无需其他仪器和专业的人员，结果判断直观可靠。

本发明的第二个目的是提供一种检测牛血清中牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌的胶体金双联检测卡的制备方法，其制备方法简单。

为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，包括壳体，所述壳体上设有加样孔和观察窗，壳体内设有胶体金试纸条，其特征在于,所述胶体金试纸条包括底板，所述底板上依次衔接有样品垫、金标垫、包被膜和吸水垫；所述的包被膜上设有一条牛结核分枝杆菌膜蛋白MPB70-MPB83检测线T1、一条牛布鲁士杆菌LPS检测线T2和羊抗兔多克隆抗体质控线C，该三条线平行排列。

进一步的，上述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，所述包被膜两端分别与吸水垫和金标垫相互交叠连接，所述样品垫压贴在金标垫上。

进一步的，上述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，所述样品垫为玻璃纤维样品垫。

进一步的，上述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，所述底板为PVC板。

进一步的，上述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，所述包被膜为硝酸纤维素膜。

本发明的第二个技术方案是这样的：

该牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡的制备方法，依次包括下述步骤：在底板上依次衔接有样品垫、金标垫、包被膜和吸水垫得胶体金试纸条，将胶体金试纸条放置与壳体内；

其中：

一)牛布鲁氏杆菌脂多糖通过下述步骤制得：

采用热酚水法提取粗牛布鲁氏杆菌脂多糖后，在0.01MpH7.4的PBS中透析48h，中间换透析液6次，透析完成后在脂多糖溶液中加入10ug/ml的DNA酶和10ug/ml的RNA酶，37℃孵育40min，加入15ug/ml的蛋白酶K37℃孵育1h，冷却，离心分离，收集上清，加入2倍体积无水乙醇，沉淀后即的牛布鲁氏杆菌脂多糖；

三)MPB70-MPB83融合蛋白通过下述步骤制得：

构建重组质粒pET70-83-C10-E6,将重组质粒pET70-83-C10-E6转化BL21细胞，将转化的细胞涂布于卡那霉素的LB琼脂平板上，挑 单菌落于Kan+的LB液体培养基中，加IPTG至终浓度0.6mmol/l，继续振摇3h，离心收集菌，超声波裂解细菌，将蛋白上清用Ni-NTA His Bind Purification Kit(Ni-NTAHis融合标签蛋白纯化试剂)纯化，用紫外分光光度计测定蛋白浓度，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳分析与设计的融合蛋白分子量符合，经ELISA测定后蛋白活性较好；

三)兔抗牛抗体的制备

以牛源抗体为免疫源免疫新西兰大白兔得到兔抗牛二抗；

四)兔抗牛-胶体金复合物的制备

(1)胶体金的制备

在三角瓶中加100ml超纯水置恒温加热磁力搅拌器上加热至沸腾，加入1ml1％氯金酸溶液，重新沸腾后再加入1.6ml二水柠檬酸三钠，继续加热至沸腾后15min停止加热，恢复至室温后加入超纯水恢复至原体积，4℃保存备用；

(2)兔抗牛-胶体金的复合物

胶体金溶液在搅拌下用0.1mol/L的碳酸钾调节胶体金溶液pH至9.0，按每毫升胶体金溶液15微克的量缓慢加入浓度为1mg/ml的兔抗牛IgG，室温下继续搅拌50min，加入10％BSA溶液至终浓度为1％，室温下继续搅拌50min，搅拌停止后离心分离，收集沉淀，上层胶体金溶液在4℃，8500r/min离心30min收集沉淀，沉淀用复溶液按照标记胶体金体积的1/30复溶，4℃保存备用；

五)金标垫的制备

制备好的兔抗牛-胶体金复合物按3ul/cm的量喷于玻璃纤维上， 37℃烘干3h后密封干燥保存备用；

六)检测线，质控线的包被

用0.01mol/LpH7.4的PBS溶液稀释融合蛋MPB70-MPB83至浓度2mg/ml，按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上，用0.01mol/LpH为7.4的PBS溶液稀释牛布鲁氏杆菌脂多糖至浓度3mg/ml，按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上，用0.01molpH为7.4的PBS溶液稀释羊抗兔IgG至1mg/ml，按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上，三条线之间的间隔为5mm，包被后的膜于37℃干燥，密封保存备用；

七)样品垫的制备

将玻璃纤维置于样品垫处理液中浸泡5min后，于37℃干燥后密封保存备用。

进一步的，上述的牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡的制备方法，所述的复溶液为20mMpH为9.0的Tris-HCl缓冲液，其中BSA含量为0.5％，吐温-20为0.3％，PVP-40为1％，

进一步的，上述的牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡的制备方法，所述的样品垫处理液为50mmol/LpH9.0的Tris-HCl溶液，其中BSA的含量为0.1％，酪蛋白含量为0.5％，曲拉通-100的含量为0.3％，PVP-40的含量为1.5％。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优点：

1、本发明提供的胶体金检测卡与传统检测方法符合率高特异性好。采用本发明胶体金检测卡检测结核菌素皮内变态反应试验中，阳性的63阳性血清中检测有52份检测是阳性，符合率为83％。 检测结核菌素皮内变态反应试验中阴性的78份血清中有70份为阴性，符合率为89％。同时本新型胶体金检测卡检测牛传染性鼻气管炎、牛口蹄疫、牛巴贝斯病阳性血清时均为阴性。

2、本发明提供的胶体金检测卡与传统检测方法相比，操作简便，结果判读快速。实用检测卡时无需专业人员，也无需其他较贵的试剂，只需将检测血清用生理盐水稀释后滴入加样空中即可，5-15min判读结果

3、本发明提供的胶体金检测卡结果显示形象直观，检测卡以T1处和T2处是否有红条带的出现来判读结果，即T1处和T2处均为出现红色条带时表示待检血清中不含有牛结核分支杆菌抗体和牛布鲁氏杆菌，当T1处出现红色条带时表示待检血清中含有牛结核分支杆菌抗体，T2处出现红色条带时表示待检测血清中含有牛布鲁氏杆菌。无论何种情况C处都有红色条带出现，如果C处无红色条带出现表示检测卡失效或过期。

4、本发明提供的胶体金检测卡成本低，实用时不需要任何配套的仪器设备和试剂。

5、本发明提供的胶体金检测卡易基层推广。由于本检测卡在实用过程中不需要专业人员操作和配套的仪器，因此能满足基层的需要，如养殖场，卫生防疫站，基层畜牧单位等，具有较广泛的实用面。

6、发明提供的胶体金检测卡制备方法简单。

总而言之，本发明提供的检测牛血清中牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌的胶体金双联检测卡，可同时检测牛血清标本中的牛结核分枝 杆菌和牛布鲁氏杆菌。具有检测时间短、稳定性好、操作简单、无需其他仪器和专业的人员，结果判断直观可靠，适合用于基层和现场大批量标本的检测。

附图说明

图1为本发明提供的检测卡结构布置图；

图2本发明提供的检测卡判定待测样品检测结果含牛结核分支杆菌抗体和牛布鲁氏杆菌的示意图；

图3本发明提供的检测卡判定待测样品检测结果含有牛结核分支杆菌抗体，不含牛布鲁氏杆菌的示意图；

图4本发明提供的检测卡判定待测样品检测结不含有牛结核分支杆菌抗体，含牛布鲁氏杆菌的示意图；

图5为检测卡判定结果为检测卡失效的示意图。

图中，壳体1；壳体盖11；加样孔2；观察窗3；底板4；样品垫5；金标垫6；包被膜7，吸水垫8，牛结核分枝杆菌膜蛋白MPB70-MPB83检测线T1，一条牛布鲁士杆菌LPS检测线T2，羊抗兔多克隆抗体质控线C。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

本发明提供的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡，参阅图1，包括壳体1，所述壳体1上设有加样孔2和观察窗3，壳体1内设有胶体金试纸条，其特征在于,所述胶体金试纸条包括底板4，所述底板4上依次衔接有样品垫5、金标垫6、包被膜7和吸水垫8；所述的包被膜7上设有一条牛结核分枝杆菌膜蛋白MPB70-MPB83检测线T1、一条牛布鲁士杆菌LPS检测线T2和羊抗兔多克隆抗体质控线C，该三条线平行排列。

具体的说，所述包被膜7两端分别与吸水垫8和金标垫6相互交叠连接，所述样品垫5压贴在金标垫6上，所述样品垫5为玻璃纤维样品垫，所述底板4为PVC板；所述包被膜7为硝酸纤维素。

牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡的组装：

1)胶体金试纸条的组装。样品垫5、金标垫6、包被膜7、吸水垫8依次粘贴在PVC底板4上面。样品垫5的末端与金标垫6相连，金金标垫6末端与包被膜7相连，包被膜7另一端与吸水垫8相连。硝酸纤维素膜检测线T1处包被有MPB70-MPB80融合蛋白，检测线T2处包被有LPS，质控线C处包被有羊抗兔多抗。

2)组装好的胶体金试纸条放入卡壳1内，卡壳盖扣在卡壳1上。硝酸纤维素膜检测线T1与卡壳1上的T1处对应，检测线T2与卡壳1T2处对应，质控线C与卡壳1的C处对应。

3)组装好的检测卡放于铝箔袋中，铝箔袋中放有干燥剂和一次性滴管。

二、检测卡中所用材料的制备方法如下：

1、牛布鲁氏杆菌脂多糖的制备

采用热酚水法提取牛布鲁氏杆菌脂多糖后在0.01MpH7.4的PBS中透析48h中间换透析液6次。透析完成后在脂多糖溶液中加入10ug/ml的DNA酶和10ug/ml的RNA酶，37℃孵育40min，加入15ug/ml的蛋白酶K37℃孵育1h，冰浴冷却，1500r/min离心20min，收集上清，加入2倍体积无水乙醇，沉淀后即的脂多糖。

2、脂多糖浓度的测定

蒽酮-硫酸法测定，以葡萄糖为标品绘制浓度标准曲线，以葡萄糖含量为横坐标，OD486nm吸光度为纵坐标，制得标准曲线。

3、MPB70-MPB83融合蛋白的制得

构建重组质粒pET70-83-C10-E6,将重组质粒转化BL21(DE3)细胞。将转化的细胞涂布于卡那霉素(Kan)(25mg/ml)的LB琼脂平板上，挑单菌落于Kan+的LB液体培养基中，加IPTG至终浓度0.6mmol/l，继续振摇3h.离心收集菌。超声波裂解细菌，将蛋白上清用Ni-NTAHisBindPurificationKit纯化，用紫外分光光度计测定蛋白浓度。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳分析与设计的融合蛋白分子量符合，经ELISA测定后蛋白活性较好。

4、兔抗牛抗体的制备

以牛源抗体为免疫源免疫新西兰大白兔得到兔抗牛二抗。

5、兔抗牛-胶体金复合物的制备

(1)胶体金的制备

洗干净的300ml三角瓶中加100ml超纯水置恒温加热磁力搅拌器 上加热至沸腾，加入1ml1％的氯金酸溶液，重新沸腾后再加入1.6ml二水柠檬酸三钠，继续加热至沸腾后15min停止加热，恢复至室温后加入超纯水恢复至原体积。4℃保存备用。

(2)兔抗牛-胶体金的标记

胶体金溶液在磁力搅拌器搅拌下用0.1mol/L的碳酸钾调剂胶体金溶液的pH至9.0。按每毫升胶体金溶液15微克的量缓慢加入浓度为1mg/ml的兔抗牛IgG。室温下继续搅拌50min，加入10％BSA溶液至终浓度为1％，室温下继续搅拌50min。搅拌停止后4000r/min离心20min，收集沉淀，上层胶体金溶液在4℃8500r/min离心30min收集沉淀。沉淀用复溶液按照标记胶体金体积的1/30复溶。4℃保存备用。复溶液为20mMpH为9.0的Tris-HCl缓冲液，其中BSA含量为0.5％，吐温-20为0.3％，PVP-40为1％。

6、金标垫的制备

制备好的兔抗牛-胶体金复合物按3ul/cm的量喷于玻璃纤维上，37℃烘干3h后密封干燥保存备用。

7、检测线，质控线的包被

用0.01mol/LpH为7.4的PBS溶液稀释融合蛋MPB70-MPB83至2mg/ml的浓度，按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上。用0.01mol/LpH为7.4的PBS溶液稀释脂多糖至3mg/ml的浓度，按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上。用0.01molpH为7.4的PBS溶液稀释羊抗兔IgG至1mg/ml按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上。三条线之间的间隔为5mm。包被后的膜于37℃鼓风干燥箱中烘干过夜后干燥密封保存备 用。

8、样品垫的制备

将玻璃纤维至于样品垫处理液中浸泡5min后于37℃的鼓风干燥箱中干燥后密封保存备用。样品垫处理液为50mmol/LpH为9.0的Tris-HCl溶液，其中BSA的含量为0.1％，酪蛋白含量为0.5％，曲拉通-100的含量为0.3％，PVP-40的含量为1.5％。

9、胶体金检测卡的组装

将制备好的样品垫5、金标垫6、包被膜7和吸水纸依次粘贴在PVC底板上。用裁切机将其斩切成宽度为3mm宽的胶体金试纸条，胶体金试纸条装在卡壳1中，卡壳1扣在卡壳1上面。组装好的检测卡放于有干燥剂的铝箔袋中密封保存。

三、检测卡的使用

取待检血清10ul加入200ul的生理盐水中混匀，用移液枪取80ul混匀后的生理盐水加入检测卡的加样空中，10-15min观察结果。

四、检测结果的判读

当检测样本中含有牛结核分支杆菌抗体和牛布病抗体时，检测卡的T1处T2处C处均出现红色条带，当检测卡T1处和C处分别出现红色条带时表示血清中含有牛结核分支杆菌抗体，当检测卡T2处和C处出现红色条带时表示待检血清中含有牛布鲁氏杆菌，当只有C处出现红色条带时表示待检血清中不含有牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌，当检测卡C处不出现红色条带时表示检测卡已经失效或过期。

以上结合最佳实施例对本发明进行了描述，但本发明并不局限于以上揭示的实施例，而应当涵盖各种根据本发明的本质进行的修改、等效组合。