牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡及其制备方法与流程

文档序号:12061548阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡,包括壳体(1),所述壳体(1)上设有加样孔(2)和观察窗(3),壳体(1)内设有胶体金试纸条,其特征在于,所述胶体金试纸条包括底板(4),所述底板(4)上依次衔接有样品垫(5)、金标垫(6)、包被膜(7)和吸水垫(8);所述的包被膜(7)上设有一条牛结核分枝杆菌膜蛋白MPB70-MPB83检测线T1、一条牛布鲁士杆菌LPS检测线T2和羊抗兔多克隆抗体质控线C,该三条线平行排列。

2.根据权利要求1所述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡,其特征在于,所述包被膜(7)两端分别与吸水垫(8)和金标垫(6)相互交叠连接,所述样品垫(5)压贴在金标垫(6)上。

3.根据权利要求1所述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡,其特征在于,所述样品垫(5)为玻璃纤维样品垫。

4.根据权利要求1所述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡,其特征在于,所述底板(4)为PVC板。

5.根据权利要求1所述的一种牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡,其特征在于,所述包被膜(7)为硝酸纤维素膜。

6.制备权利要求1所述的牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡,其特征在于,依次包括下述步骤:在底板(4)上依次衔接有样品垫(5)、金标垫(6)、包被膜(7)和吸水垫(8)制得胶体金试纸条,将胶体金试纸条放置与壳体(1)内;

其中:

一)牛布鲁氏杆菌脂多糖通过下述步骤制得:

采用热酚水法提取粗牛布鲁氏杆菌脂多糖后,在0.01MpH7.4的PBS中透析48h,中间换透析液6次,透析完成后在脂多糖溶液中加入10ug/ml的DNA酶和10ug/ml的RNA酶,37℃孵育40min,加入15ug/ml的蛋白酶K37℃孵育1h,冷却,离心分离,收集上清,加入2倍体积无水乙醇,沉淀后即的牛布鲁氏杆菌脂多糖;

二)MPB70-MPB83融合蛋白通过下述步骤制得:

构建重组质粒pET70-83-C10-E6,将重组质粒pET70-83-C10-E6转化BL21细胞,将转化的细胞涂布于卡那霉素的LB琼脂平板上,挑单菌落于Kan+的LB液体培养基中,加IPTG至终浓度0.6mmol/l,继续振摇3h,离心收集菌,超声波裂解细菌,将蛋白上清用Ni-NTAHis融合标签蛋白纯化试剂纯化,用紫外分光光度计测定蛋白浓度,纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳分析与设计的融合蛋白分子量符合,经ELISA测定后蛋白活性较好;

三)兔抗牛抗体的制备

以牛源抗体为免疫源免疫新西兰大白兔得到兔抗牛二抗;

四)兔抗牛-胶体金复合物的制备

(1)胶体金的制备

在三角瓶中加100ml超纯水置恒温加热磁力搅拌器上加热至沸腾,加入1ml1%氯金酸溶液,重新沸腾后再加入1.6ml二水柠檬酸三钠,继续加热至沸腾后15min停止加热,恢复至室温后加入超纯水恢复至原体积,4℃保存备用;

(2)兔抗牛-胶体金的复合物

胶体金溶液在搅拌下用0.1mol/L的碳酸钾调节胶体金溶液pH至9.0,按每毫升胶体金溶液15微克的量缓慢加入浓度为1mg/ml的兔抗牛IgG,室温下继续搅拌50min,加入10%BSA溶液至终浓度为1%,室温下继续搅拌50min,搅拌停止后离心分离,收集沉淀,上层胶体金溶液在4℃,8500r/min离心30min收集沉淀,沉淀用复溶液按照标记胶体金体积的1/30复溶,4℃保存备用;

五)金标垫的制备

制备好的兔抗牛-胶体金复合物按3ul/cm的量喷于玻璃纤维上,37℃烘干3h后密封干燥保存备用;

六)检测线,质控线的包被

用0.01mol/LpH7.4的PBS溶液稀释融合蛋MPB70-MPB83至浓度2mg/ml,按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上,用0.01mol/LpH为7.4的PBS溶液稀释牛布鲁氏杆菌脂多糖至浓度3mg/ml,按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上,用0.01molpH为7.4的PBS溶液稀释羊抗兔IgG至1mg/ml,按1ul/cm的量划于硝酸纤维素膜上,三条线之间的间隔为5mm,包被后的膜于37℃干燥,密封保存备用;

七)样品垫的制备

将玻璃纤维置于样品垫处理液中浸泡5min后,于37℃干燥后密封保存备用。

7.根据权利要6所述的牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡的制备方法,其特征在于,所述的复溶液为20mMpH为9.0的Tris-HCl缓冲液,其中BSA含量为0.5%,吐温-20为0.3%,PVP-40为1%。

8.根据权利要6所述的牛结核分枝杆菌和牛布鲁氏杆菌双联检测卡的制备方法,其特征在于,所述的样品垫处理液为50mmol/L pH9.0的Tris-HCl溶液,其中BSA的含量为0.1%,酪蛋白含量为0.5%,曲拉通-100的含量为0.3%,PVP-40的含量为1.5%。

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