一种双和汤标准汤的HPLC指纹图谱测定方法与流程

本发明涉及属于中药技术领域，具体是一种双和汤标准汤的HPLC指纹图谱测定方法。

背景技术：

双和汤首载于南宋时期的《太平惠民和剂局方》卷五中，治诸虚，为宝庆新增方。原方记载为白芍药(七两半)，当归(洗，酒浸)、黄芪(蜜炙)、川芎、熟地黄(净洗，酒蒸，各三两)，甘草(炙)、肉桂(去皮，不见火，各二两二钱半)。上为细末，每服二钱，水一盏半，生姜三片，枣一枚，煎去六分，空心，食前服。治男子、妇人五劳、六极、七伤，心肾俱虚，精血气少，遂成虚劳。百骸枯瘁，四肢倦怠，寒热往来，咳嗽咽干，行动喘乏，面色黄，略有所触，易成他疾。或伤于冷，则宿食不消，脾疼腹痛，泻痢吐逆；或伤于热，则头眩眼晕，痰涎气促，五心烦热；或因饥饱动作，喜怒惊恐，病随而至，或虚胀而不思食，或多食而不生肌肉，心烦则虚汗盗汗，一切虚劳不敢服燥药者，并宜服之。常服调中养气，益血育神，和胃进食，补虚损。忌生冷、果子等物。

宋朝时期的《增广太平惠民和剂局方》卷五·宝庆新增方中，补虚损。组成同《太平惠民和剂局方》。

元朝时期，危亦林的《世医得效方》卷第八·十方脉杂医科中，虚损。组成同《太平惠民和剂局方》。

明朝时期，董宿的《奇效良方》卷之二十一·诸虚通治方中，治男子妇人，五劳七伤，气血不足，面色痿黄，四肢倦乏，将为虚劳之证，常服养气益血。上口父咀，每服三钱，水一盏，生姜三片，枣一枚，煎，空心服。组成同《太平惠民和剂局方》。

清朝时期，吴谦的《医宗金鉴》卷二十六·册补名医方论(一)、杂病心法要诀·卷四十·虚劳治法、妇科心法要诀·卷四十四·调经证治和妇科心法要诀·卷四十四·调经门汇方中的双和饮，治大病之后，虚劳气乏。补血益气，不热不冷，温而调之。白芍二钱，黄芪炙一钱半，甘草炙七分，中桂七分，当归一钱，熟地黄一钱，川芎七分，生姜三片，大枣二枚，水二盏，煎一盏，温服。虚劳，若里不急、腹不痛有是证者，则当以温养气血。妇科·调经证治，平补气血，即十全大补汤减人参、茯苓、白术也。吴谦的《名医方论》亦记载双和饮。

现代王世民的《局方别裁》第六章补益剂中收载双和汤，“温补气血”(1992版)。谢海洲的《中医历代良方全书》中，双和汤为《太平惠民和剂局方》方，又名双和饮。白芍、熟地、黄芪、当归各10克，川芎、炙甘草、肉桂各4.5克。水煎服。功能补阴血，养阳气。治大病后期，阴血阳气未复，气短乏力，晕眩、心悸，舌质淡，脉濡弱。现代临床上常用于疲劳、久病体质虚弱、精力缺乏的症状。近年来双和汤的临床应用研究已有报道：韩国韩医院研究院的马珍烈等人利用双和汤或双和汤的乳酸杆菌发酵物制备成两种保健食品，一种应用于酒精引起的宿醉；另一种用于治疗骨质疏松症。

中药经典名方汤剂作为传统的中医临床用药的主要剂型，具有组方合理、疗效确切、易于吸收、起效较快等优点,深受广大患者的信赖。却因调配、携带、临时煎煮、久置容易发生霉败变质、汤液味苦和量大，以及标准难以统一，严重影响其临床疗效等缺点，不能适应现代人的生活要求。为了保持汤剂的优势,克服汤剂的种种不足,在国家科技部“重大新药创制”科技重大专项项目的大力支持下及院士、行业专家的反复探讨后，以经典名方基准汤的质量属性为评价指标，生产出与其在质量及药效基本保持一致的标准颗粒剂。

“经典名方标准颗粒”系指以基准汤剂的关键质量属性为评价指标，对颗粒制备过程的药材提取、浓缩、干燥等关键工艺进行研究，应用现代生产技术制备与基准汤剂的关键质量属性基本一致的颗粒。

根据《经典名方标准颗粒研究专家共识—基准汤剂定义、制备、质量属性及应用》有关要求，进行双和汤基准汤的相关考察和研究。

与指标成分含量测定的质量分析方法相比，指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制，是目前中药及其制剂质量控制的有效手段之一。中药指纹图谱的检测方法有色谱法、光谱法、波谱法等。色谱法主要包括薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳等，其中高效液相色谱法具有高效、快速、灵敏、重现性好的特点，与紫外检测器(UV)、二甲管阵列检测器(DAD)、蒸发光散射检测器(ELSD)和质谱检测器(MS)等多种检测器联用，可用于中药中多种复杂成分的分析检测，现已成为中药指纹图谱研究的主流方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提供一种双和汤标准汤的HPLC指纹图谱测定方法，有效的控制了双和汤标准颗粒剂的质量，保证了药物的疗效，使经典名方得到了更为正规的质量控制。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种双和汤标准汤的HPLC指纹图谱测定方法，包括如下步骤：

(1)供试样品溶液的制备：精密量取不同批次的双和汤的标准汤，加载于已活化好的SPE柱，先用30体积份数的纯水洗脱，弃去洗脱液，再用10重量份数的甲醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液低温浓缩至干，最后用2体积份数的甲醇溶解，用微孔滤膜过滤，取续滤液，得供试样品溶液，备用；

(2)混合对照品溶液的制备：精密称取5-HMF、芍药苷、毛蕊异黄酮苷、甘草苷、阿魏酸、桂皮醛、甘草酸、6-姜酚对照品适量，加甲醇配制成每1体积份数含5-HMF、芍药苷、毛蕊异黄酮苷、甘草苷、阿魏酸、桂皮醛、甘草酸、6-姜酚分别为0.01、0.12、0.03、0.01、0.01、0.04、0.05和0.03重量份数的混合对照品溶液，摇匀，滤过，备用；

(3)单味药材阴性对照品溶液的制备：按照3倍处方量称取各单味药材粉末，粉碎，过筛得粗粉，取3倍处方量粗粉至全自动煎药锅中，精密量取纯水，浸泡，煎煮，煎煮期间搅拌，趁热过滤，滤液混合均匀，取适量用纯水定容至250mL容量瓶中即为单味药材阴性对照品溶液，备用；

(4)分别精密吸取供试样品溶液、混合对照品溶液和单味药材阴性对照品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，分别得到供试样品溶液、混合对照品溶液和单味药材阴性对照品溶液的液相色谱；

(5)采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，对供试样品溶液、混合对照品溶液和单味药材阴性对照品溶液的液相色谱进行数据匹配，即得标准指纹图谱。

所述重量份数与所述体积份数的关系为g/mL。

进一步地，所述步骤(4)的色谱条件如下：

色谱柱：Accurasil C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；

流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液；

流速：1.0mL/min；

波长：280nm；

进样量：10μL；

柱温：30℃；

理论塔板数按芍药苷峰计算不低于7000；

梯度洗脱程序见表1：

表1指纹图谱梯度洗脱程序

进一步地，所述标准指纹图谱包括16个共有峰：峰2、3、4来自白芍，峰5来自炙黄芪，峰6、11、14来自炙甘草，峰7、8、9、16来自酒当归和川芎，峰10、12、13来自肉桂，峰15来自生姜，峰1来自酒熟地、川芎，以4号峰为参照峰。

进一步地，所述标准指纹图谱中1号峰为5-HMF，4号峰为芍药苷，5号峰为毛蕊异黄酮苷，6号峰为甘草苷，7号峰为阿魏酸，13号为桂皮醛，14号峰为甘草酸，15号为6-姜酚。

进一步地，所述步骤(1)中用0.22μm微孔滤膜过滤。

进一步地，所述单味药材阴性对照品溶液的制备方法如下：按照3倍处方量称取各单味药材粉末，粉碎，过10-40目筛得粗粉；取3倍处方量粗粉至全自动煎药锅中，精密量取900mL纯水倒入，浸泡30min，煎煮75min，煎煮期间搅拌三次，趁热用300目滤布过滤，滤液体积约为500mL，滤液混合均匀，取三分之一用纯水定容至250mL容量瓶中即为单味药材阴性对照品溶液，备用。

进一步地，所述双和汤的标准汤的制备方法如下：按照处方比例称取九味药材，粉碎，过10-40目筛得粗粉；取三倍处方量粗粉至全自动煎药锅中，精密量取900mL纯水倒入，浸泡30min，煎煮75min，煎煮期间搅拌三次，趁热用300目滤布过滤，滤液体积约为500mL，滤液混合均匀，取三分之一用纯水定容至250mL容量瓶中即为标准汤原液，备用。

本发明还提供了上述方法在双和汤的药物制剂的质量检测和质量控制中的应用。

本发明还提供了一种双和汤标准颗粒的质量控制方法，包括以下步骤：

(1)按照上述测定方法建立双和汤标准汤的标准指纹图谱；

(2)取待检的双和汤标准颗粒，按照上述测定方法得到指纹图谱；

(3)将步骤(2)得到的指纹图谱与步骤(1)得到的标准指纹图谱进行对比，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。

双和汤标准颗粒供试样品溶液的制备：取装量差异项下的双和汤标准颗粒，研细，取约5g，精密称定，置100mL量瓶中，加水适量，超声处理(功率250W，频率50kHz)10min使溶解，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取4ml混悬液至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声处理(功率250W，频率50kHz)10min，然后离心(转速为每分钟8000转)15min，精密移取上清液，滤过，取续滤液，即得。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

(1)本发明在建立双和汤标准颗粒的指纹图谱过程中，确认了16个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积进行了研究，保证了制剂的化学组成稳定性和使用安全性。

(2)双和汤标准颗粒中化学成分复杂，要实现其特征指纹峰的分离难度大，本发明在建立起指纹图谱的过程中，采用了梯度洗脱的方法，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题。

(3)建立双和汤标准颗粒的指纹图谱，克服了单一成分含量测定难以反映整体含量的缺陷，可以从整体上、宏观上控制双和汤标准颗粒剂的内在质量，保证了药物的疗效，使经典名方得到了更为正规的质量控制。

(4)以双和汤标准颗粒中各有效成分指纹图形作为一个整体看待，注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定双和汤标准颗粒整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。为完整、准确评价双和汤标准颗粒的质量提供了新的方法和手段。

(5)本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。

附图说明

图1为不同厂家色谱柱HPLC对比图谱。

图2为不同柱温HPLC对比图谱。

图3为200-400nm全波长扫描图。

图4为不同波长HPLC对比图谱。

图5为不同梯度HPLC对比图谱。

图6为不同前处理HPLC对比图谱。

图7为10批标准汤HPLC对比图谱。

图8为10批标准汤指纹图谱(匹配后)。

图9为10批标准汤指纹图谱(共有模式图谱)。

图10为混合对照品和全方HPLC对比图谱。

图11为全方与单味药材阴性对照指纹图谱比较图谱。

具体实施方式

实施例一双和汤标准汤的HPLC指纹图谱测定方法

1.1仪器和试剂

仪器：

试剂：

1.2样品制备：

1.2.1样品及供试样品溶液的制备

(1)样品的制备：按照处方比例称取九味药材，粉碎，过10-40目筛得粗粉；取三倍处方量粗粉至全自动煎药锅中，精密量取900mL纯水倒入，浸泡30min，煎煮75min，煎煮期间搅拌三次，趁热用300目滤布过滤，滤液体积约为500mL，滤液混合均匀，取三分之一用纯水定容至250mL容量瓶中即为标准汤原液，备用，根据此方法制备10批各不同批次的标准汤。

(2)供试样品溶液的制备：从10批标准汤中分别精密量取4mL，加载于已活化好的SPE柱，先用30mL纯水洗脱，弃去洗脱液，再用10mL甲醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液低温浓缩至干，最后用2mL甲醇溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得供试品溶液，备用。

1.2.2混合对照品溶液的制备：精密称取5-HMF、芍药苷、毛蕊异黄酮苷、甘草苷、阿魏酸、桂皮醛、甘草酸、6-姜酚对照品适量，加甲醇配制成每1mL含5-HMF、芍药苷、毛蕊异黄酮苷、甘草苷、阿魏酸、桂皮醛、甘草酸、6-姜酚分别为0.01、0.12、0.03、0.01、0.01、0.04、0.05和0.03mg的混合对照品溶液，摇匀，滤过，备用。

芍药苷(批号：110736-201539纯度≥96.4％)，阿魏酸(批号：110773-201313纯度≥99.6％)，甘草苷(批号：11610-201106纯度≥93.7％)，甘草酸(批号：110731-201418纯度≥93.1％)，桂皮醛(批号：110710-201408纯度≥99.4％)均购自中国食品药品检定研究院；5-HMF(批号：h40807纯度≥99.0％)，毛蕊异黄酮苷(批号：AB019C纯度≥98.0％)，6-姜酚(批号：AW025G01纯度≥99.0％)均购自天津市一方科技有限公司。

1.2.3单味药材阴性对照品溶液的制备：按照3倍处方量称取各单味药材粉末，粉碎，过10-40目筛得粗粉；取3倍处方量粗粉至全自动煎药锅中，精密量取900mL纯水倒入，浸泡30min，煎煮75min，煎煮期间搅拌三次，趁热用300目滤布过滤，滤液体积约为500mL，滤液混合均匀，取三分之一用纯水定容至250mL容量瓶中即为单味药材阴性对照品溶液，备用。

1.3色谱条件

色谱柱：Accurasil C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；

流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液；

流速：1.0mL/min；

波长：280nm；

进样量：10μL；

柱温：30℃；

理论塔板数按芍药苷峰计算不低于7000；

梯度洗脱程序见表1：

表1指纹图谱梯度洗脱程序

1.3.1色谱柱的选择

分别比较资生堂C18，Cosmosil C18，Accurasil C18三个厂家的色谱柱，结果见图1。(A：PAK C18色谱柱B：Cosmosil C18色谱柱C：Accurasil C18色谱柱)

从图1可知：样品在AccurasilC18色谱柱下各色谱峰的分离度良好，特征峰明显且峰形较好。因此最终选择AccurasilC18色谱柱作为HPLC指纹图谱的色谱柱。

1.3.2柱温的选择

分别对20℃、30℃和40℃的柱温条件进行筛选和优化，结果见图2。(A：20℃B：40℃C：30℃)

从图2可知：柱温30℃条件下色谱峰分离度良好，受干扰因素影响小。因此最终选择柱温30℃作为HPLC指纹图谱的最佳柱温条件。

1.3.3检测波长的选择

采用PDA检测器对样品进行200-400nm范围内全波长扫描，对230、254、280nm波长下的色谱图进行比较，结果见图3、图4。(A：波长230nm B：波长254nm C：波长280nm)

从上图3、图4可知：三个波长下色谱峰的数目、吸收强度、分离度存在差异，综合考虑，当波长在280nm时，色谱峰数目最多，各个色谱峰吸收强度较平均，且分离度良好，因此最终选用280nm波长为最佳检测波长。

1.3.4流动相的选择

首先对流动相系统水-乙腈、0.1％磷酸水溶液-乙腈、1％醋酸-乙腈、水-甲醇、0.1％磷酸水溶液-甲醇、1％醋酸水溶液-甲醇进行筛选。结果0.1％磷酸水溶液-乙腈分离度良好，特征峰明显，最终确定0.1％磷酸水溶液-乙腈为流动相系统。其次又优化了不同比例洗脱梯度，洗脱梯度1、2、3如下表2-1、表2-2、表2-3，结果见图5。(A：梯度1B：梯度2C：梯度3)

表2-1双和汤HPLC指纹图谱梯度1洗脱表

表2-2双和汤HPLC指纹图谱梯度2洗脱表

表2-3双和汤HPLC指纹图谱梯度3洗脱表

从图5可知：洗脱梯度3条件下色谱峰分离度良好，保留时间适宜，因此最终选择梯度3作为最佳洗脱梯度。

1.3.5样品前处理的选择

对样品原液、60％甲醇醇沉法及SPE固相萃取法进行了筛选，结果见图6。(A：SPE固相萃取B：60％甲醇沉法2C：样品原液)

从图6可知：SPE固相萃取取法富集样品在色谱条件下色谱峰数目较多，且各色谱峰紫外吸收和分离度良好，因此最终选择SPE固相萃取法富集法为最佳前处理法。

1.4方法学考察

1.4.1仪器精密度试验

取1.2.2项下方法制备混合对照品溶液，按1.3项下的色谱条件，连续进样5次，每次进样10μL，以芍药苷色谱峰(4号峰)的保留时间和峰面积作为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，RSD分别为0.4％和2.2％，均小于3.0％，表明本仪器精密度良好。

1.4.2稳定性试验

取1.2.1(2)项下方法制备供试样品溶液，按1.3项下的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24h进样1次，每次进样10μL，以芍药苷色谱峰的保留时间和色谱峰作为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，RSD分别为0.7％和2.8％，均小于3.0％，表明该样品在24h内稳定性良好。

1.4.3重复性试验

按双和汤原处方组成，平行称取各味药5份，按1.2.1(1)项下方法制备，且按1.2.1(2)项下方法制备供试样品溶液5份，按1.3项下的色谱条件，每份供试品溶液进样10μL，以芍药苷色谱峰的保留时间和峰面积作为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差RSD值，RSD分别为1.3％和2.5％，均小于3.0％，表明本方法重复性良好。

1.5 HPLC指纹图谱的建立及技术参数分析

1.5.1图谱采集

取1.2.1(1)项下方法制备的10批标准汤，按1.2.1(1)项下方法制备供试样品溶液，按1.3项下的色谱条件进行测定，进样量10μL，记录HPLC指纹图谱，结果见图7。

1.5.2参照峰的选择

首先芍药苷为君药白芍的主要活性成分，其次从供试品溶液指纹图谱可知，芍药苷为已知化学成分，且化学性质稳定，其色谱峰在各色谱峰中，分离度较好和峰面积较大的，故选取4号峰(芍药苷)作为指纹图谱的参照峰。

1.5.3共有峰的标定和共有峰的相对保留时间和相对峰面积的计算

采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，对10批汤剂图谱进行数据匹配，结果见图8。由图8可见，其中16个峰为10批汤剂所共有，因此确定16个峰为共有色谱峰，以中位数法确定共有模式，结果见图9，以芍药苷峰(4号峰)的保留时间和色谱峰面积为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3、表4。

表3双和汤标准汤剂共有峰相对保留时间

表4双和汤标准汤剂共有峰相对峰面积

从表3、表4可见：10批双和汤标准汤剂的共有峰的相对保留时间RSD≤0.82％，相对峰面积RSD≤0.82％，两者均小于3％，因此该方法可用于双和汤的HPLC指纹图谱测定。

1.5.4特征峰的指认

首先采用混合对照品比较法进行特征峰指认，分别精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结构见图10。A(1：5-HMF 4：芍药苷5：毛蕊异黄酮苷6：甘草苷7：阿魏酸13：桂皮醛14：甘草酸15：6-姜酚)

从图10可见，确定1号峰为5-HMF，4号峰为芍药苷，5号峰为毛蕊异黄酮苷，6号峰为甘草苷，7号峰为阿魏酸，13号为桂皮醛，14号峰为甘草酸，15号为6-姜酚，因此确定这8个峰为双和汤HPLC指纹图谱的特征峰。

1.5.5药材归属分析

取1.2.1(2)项下的1号汤剂供试样品溶液和1.2.3项下方法制备的单味药材阴性对照品溶液各10μL，按照1.3项下的色谱条件进行测定，得到全方和方中各单味药材阴性对照液的HPLC图谱，结果见图11。(A：全方B：白芍阴性对照C：当归阴性对照D：川芎阴性对照E：熟地阴性对照F：黄芪阴性对照G：甘草阴性对照H：肉桂阴性对照I：生姜阴性对照J：大枣阴性对照)

从图11可见：通过对比相对保留时间，对双和汤标准汤剂中共有峰的来源进行追溯，得出峰2、3、4来自君药白芍，峰5来自炙黄芪，峰6、11、14来自炙甘草，峰7、8、9、16来自酒当归和川芎，峰10、12、13来自肉桂，峰15来自生姜，峰1来自酒熟地、川芎。

3.7.6 10批双和汤标准汤样品相似度评价

采用国家药典委员会制定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，以对照谱图上标示的色谱峰作为匹配点，进行多点校正，并计算结果相似度，结果见表5。

表5 10批双和汤标准汤剂相似度计算结果

从表5可见：10批双和汤标准汤指纹图谱的相似度在0.938-0.983之间，平均值为0.978，结果表明：10批双和汤标准汤剂质量一致性较高。

实施例二双和汤标准颗粒的质量控制方法

一种双和汤标准颗粒的质量控制方法，包括以下步骤：

(1)按照实施例一中1.2.1(1)中的方法制备双和汤标准汤，采用实施例一中的测定方法建立双和汤标准汤的标准指纹图谱；

(2)取待检的双和汤标准颗粒，按照实施例一中的测定方法得到指纹图谱；

(3)将步骤(2)得到的指纹图谱与步骤(1)得到的标准指纹图谱进行对比，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。

双和汤标准颗粒供试样品溶液的制备：取装量差异项下的双和汤标准颗粒，研细，取约5g，精密称定，置100mL量瓶中，加水适量，超声处理(功率250W，频率50kHz)10min使溶解，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取4ml混悬液至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声处理(功率250W，频率50kHz)10min，然后离心(转速为每分钟8000转)15min，精密移取上清液，滤过，取续滤液，即得。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。