抑制素A定量检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种抑制素A定量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：抑制素(Inhibin，INH)是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一，为α-亚单位和β-亚单位通过二硫键连接而成的异质二聚体糖蛋白激素。β-亚单位又有βA和βB两种形式，与α-亚单位分别形成抑制素A(INHA，αβA)和抑制素B(INHB，αβB)。目前，对于人抑制素A，检测试剂盒主要采用化学发光免疫测定法，对于人抑制素B，检测试剂盒主要采用酶联免疫反应。利用化学发光免疫测定法检测时，化学发光的发射强度依赖于各种环境因素，在不同的环境体系中，发射强度和时间的曲线有较大的差别，因此，需严格控制外界的各种因素。利用酶联免疫反应检测时，反应步骤繁琐，反应时间长，且酶反应易受各种干扰因素的干扰，反应的特异性和灵敏度低。对于抑制素A的检测，如何制备一种避免上述缺陷的试剂盒，是目前抑制素A检测亟待解决的问题之一。技术实现要素：本发明主要解决的技术问题是提供一种抑制素A定量检测试剂盒及其制备方法，可利用时间分辨免疫荧光测定技术进行抑制素A的检测，避免化学发光免疫测定法和酶联免疫反应检测时的缺陷。为解决上述技术问题，本发明提供一种抑制素A定量检测试剂盒，包括实验缓冲液、增强液、浓缩洗液、标记物、校准品及包被板；实验缓冲液包括体积比为0.1-100％的小牛血清和第一缓冲液；增强液为含0.4-0.6ml/LTritonX-100的水溶液；浓缩洗液包括3-5ml/LTween-20和第二缓冲液；标记物由抑制素A单克隆抗体与镧系元素离子螯合物按1:1-1:3m/m制得；校准品包括6个浓度的冻干粉，冻干粉由抑制素A抗原和第三缓冲液冷冻干燥而成；包被板为采用包被液、封闭液、反应板制成的包被板，包被液包括0.1-10μg/mL抑制素A单克隆抗体和第四缓冲液，封闭液为第五缓冲液。其中，第一缓冲液各组分及浓度为：1-10g/LNaCl，0.1-10‰EDTA，0.1-20‰FPC，0.1-10‰鼠血清，0.1-10‰硫柳汞，0.1-10％曙红，pH7.0-8.0、5-100mmol/LTris-HCl，其中，FPC、鼠血清的浓度为体积比，EDTA、硫柳汞、曙红的浓度为质量比；增强液的水溶液包括：0.4-0.6g/L乙酸钠，0.002-0.004g/Lβ-NTA，0.020-0.030g/LTOPO，0.7-0.9‰冰醋酸，0.5-1.5‰无水乙醇，其中，冰醋酸、无水乙醇的浓度为体积比；第二缓冲液各组分及浓度为：22.4-22.6g/LNaCl，0.4-0.6ml/LFPC，0.07-0.09‰亮蓝母液，pH7.0-8.0、5-100mmol/LTris-HCl，其中，FPC、亮蓝母液的浓度为体积比；第三缓冲液各组分及浓度为：1-100g/LBSA，0.1-50g/LNaCL，0.1-10g/LNaN3，0.1-10mL/L硫柳汞，pH7.0-8.0、5-100mmol/LTris-HCl；第四缓冲液、第五缓冲液为pH7.0-8.0、5-100mmol/LTris-HCl缓冲液。其中，小牛血清的浓度为50％，TritonX-100的浓度为0.5ml/L，Tween-20的浓度为4ml/L，抑制素A单克隆抗体与镧系元素离子螯合物的比例为1:1m/m，标准品的抑制素A抗原的浓度为0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、600pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL。其中，第一缓冲液各组分及浓度为：5g/LNaCl，4‰EDTA，10‰FPC，6‰鼠血清，6‰硫柳汞，6％曙红，pH7.8、50mmol/LTris-HCl；增强液的水溶液包括：0.5g/L乙酸钠，0.003g/Lβ-NTA，0.024g/LTOPO，0.8‰冰醋酸，1‰无水乙醇；第二缓冲液各组分及浓度为：22.5g/LNaCl，0.5ml/LFPC，0.08‰亮蓝母液，pH7.8、50mmol/LTris-HCl；第三缓冲液各组分及浓度为：50g/LBSA，20g/LNaCL，5g/LNaN3，6mL/L硫柳汞，pH7.8、50mmol/LTris-HCl；第四缓冲液、第五缓冲液为pH7.8、50mmol/LTris-HCl缓冲液。其中，镧系元素为铕元素。为解决上述技术问题，本发明提供一种抑制素A定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：实验缓冲液的制备方法：在第一缓冲液中加入体积比为0.1-100％的小牛血清；增强液的制备方法：增强液为含0.4-0.6ml/LTritonX-100的水溶液；浓缩洗液的制备方法：在第二缓冲液中加入3-5ml/LTween-20；标记物的制备方法：将抑制素A单克隆抗体和镧系元素离子螯合物按1:1-1:3m/m混合，混合均匀后，28-37℃静置12-48h，将静置后的混合物经SephacryIS-200层析柱(Φ1.0×30cm)洗脱，获得标记物；校准品的制备方法：将抑制素A抗原用第三缓冲液稀释至6个浓度，将该6个浓度的液态校准品进行真空冷冻干燥，获得校准品冻干粉；包被板的制备方法：包被液包括0.1-10μg/mL抑制素A单克隆抗体和第四缓冲液，封闭液为第五缓冲液，在反应板中加入包被液，再用封闭液进行封闭，晾干，获得包被板；将制备的实验缓冲液、增强液、浓缩洗液、标记物、校准品及包被板分装、组装，完成抑制素A定量检测试剂盒的制备。其中，第一缓冲液各组分及浓度为：1-10g/LNaCl，0.1-10‰EDTA，0.1-20‰FPC，0.1-10‰鼠血清，0.1-10‰硫柳汞，0.1-10％曙红，pH7.0-8.0、5-100mmol/LTris-HCl，其中，FPC、鼠血清的浓度为体积比，EDTA、硫柳汞、曙红的浓度为质量比；增强液的水溶液包括：0.4-0.6g/L乙酸钠，0.002-0.004g/Lβ-NTA，0.020-0.030g/LTOPO，0.7-0.9‰冰醋酸，0.5-1.5‰无水乙醇，其中，冰醋酸、无水乙醇的浓度为体积比；第二缓冲液各组分及浓度为：22.4-22.6g/LNaCl，0.4-0.6ml/LFPC，0.07-0.09‰亮蓝母液，pH7.0-8.0、5-100mmol/LTris-HCl，其中，FPC、亮蓝母液的浓度为体积比；第三缓冲液各组分及浓度为：1-100g/LBSA，0.1-50g/LNaCL，0.1-10g/LNaN3，0.1-10mL/L硫柳汞，pH7.0-8.0、5-100mmol/LTris-HCl；第四缓冲液、第五缓冲液为pH7.0-8.0、5-100mmol/LTris-HCl缓冲液。其中，小牛血清的浓度为50％，TritonX-100的浓度为0.5ml/L，Tween-20的浓度为4ml/L，抑制素A单克隆抗体与镧系元素离子螯合物的比例为1:1m/m，标准品的抑制素A抗原的浓度为0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、600pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL。其中，第一缓冲液各组分及浓度为：5g/LNaCl，4‰EDTA，10‰FPC，6‰鼠血清，6‰硫柳汞，6％曙红，pH7.8、50mmol/LTris-HCl；增强液的水溶液包括：0.5g/L乙酸钠，0.003g/Lβ-NTA，0.024g/LTOPO，0.8‰冰醋酸，1‰无水乙醇；第二缓冲液各组分及浓度为：22.5g/LNaCl，0.5ml/LFPC，0.08‰亮蓝母液，pH7.8、50mmol/LTris-HCl；第三缓冲液各组分及浓度为：50g/LBSA，20g/LNaCL，5g/LNaN3，6mL/L硫柳汞，pH7.8、50mmol/LTris-HCl；第四缓冲液、第五缓冲液为pH7.8、50mmol/LTris-HCl缓冲液。其中，镧系元素为铕元素。本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明的抑制素A定量检测试剂盒包括实验缓冲液、增强液、浓缩洗液、标记物、校准品及包被板，通过上述各部分可对抑制素A进行定量检测，具体为采用时间分辨免疫荧光测定技术进行测定，在测定时，可避免化学发光免疫测定法和酶联免疫反应检测时的缺陷，且测定结果准确、可靠。附图说明图1是本发明抑制素A定量检测试剂盒剂量-反应标准曲线；图2是本发明抑制素A定量检测试剂盒热稳定性测试中荧光值走势图；图3是本发明抑制素A定量检测试剂盒与对照试剂盒样本检测线性相关性图。具体实施方式本发明抑制素A定量检测试剂盒包括实验缓冲液、增强液、浓缩洗液、标记物、校准品及包被板，上述各部分的制备方法具体如下。实验缓冲液的制备：在含5g/LNaCl、4‰EDTA、10‰FPC、6‰鼠血清、6‰硫柳汞、6％曙红的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl溶液中加入体积比为50％的小牛血清，混合均匀。增强液的制备：将0.5g/L乙酸钠、0.003g/Lβ-NTA、0.024g/LTOPO、0.8‰冰醋酸、1‰无水乙醇、0.5ml/LTritonX-100配制成水溶液，配制成的水溶液即增强液。其中，β-NTA为β-萘甲酰三氟丙酮，TOPO为三正辛基氧化磷。浓缩洗液的制备：在含22.5g/LNaCl、0.5ml/LFPC、0.08‰亮蓝母液的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl溶液中加入4ml/LTween-20，混合均匀。标记物的制备：将抑制素A单克隆抗体按照1:1m/m加入Eu-DTTA-Na瓶中，充分混匀，置于35℃静置30h，将静置后的混合物过SephacryIS-200层析柱(Φ1.0×30cm)，用50mmol/L、pH7.8的Tris-HCL缓冲液洗脱，获得标记物。此制备的标记物为母液，之后按1:30-1:50稀释使用。其中，混合比例1:1为质量比，Eu-DTTA-Na为Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠。校准品的制备：以抑制素A抗原标准物质为参比，将抑制素A抗原用缓冲液稀释成0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、600pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL6个浓度的液态校准品，将该液态校准品进行真空冷冻干燥，获得冻干粉校准品。其中，缓冲液为含50g/LBSA、25g/LNaCL、8g/LNaN3、8mL/L硫柳汞的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl溶液。包被板的制备：将抑制素A单克隆抗体用缓冲液稀释至4μg/mL，其中，缓冲液为pH7.8、50mmol/LTris-HCl缓冲液，用4μg/mL的抑制素A单克隆抗体在反应板上进行包被，将反应板洗涤1次，然后再用封闭液进行封闭，最后将反应板甩干、晾干，真空包装，2-8℃保存备用。对于上述缓冲液，还可为50mmol/L、pH9.6的碳酸缓冲液、20mmol/L、pH4.5的磷酸盐缓冲液或50mmol/L、pH4.5的柠檬酸盐缓冲液。对上述制备的实验缓冲液、增强液、浓缩洗液、Eu3+标记抑制素A抗体、校准品进行分装，对上述制备的抑制素A抗体包被的包被板进行铝箔袋封装，其中，标记物按500μL/瓶或1.1ml/瓶进行分装，校准品以500μL/瓶或1.0ml/瓶进行冷冻干燥。将分装、封装好的物品进行组装，即得本发明试剂盒。对于组装前的物品，需抽出3份进行特异性、精密性、灵敏度及稳定性检测，检测合格后才能组装。对于上述制备的试剂盒，其使用方法具体为：将试剂及所需数量的包被板平衡至室温(20-25℃)；将40ml浓缩洗液和960ml蒸馏水在干净的容器中混合，作为工作洗涤液备用；向校准品和标记物中加入相应体积的纯化水，具体地，半自动：校准品和标记物均加入0.5ml纯化水，全自动：校准品加入1.0ml纯化水，标记物加入1.1ml纯化水，加入纯化水后，充分溶解，轻轻混匀；将标记物用实验缓冲液按体积比1:30加入洁净的一次性容器中并混匀；按照25ul/孔加入校准品和样本，按照100μl/孔加入实验缓冲液，加贴封片；包被板在室温下，用振荡器缓慢振荡孵育1.5小时，孵育结束后，用洗板机洗涤4次，拍干；向每孔中加入100μl已配好的铕标记物工作液，混匀，加贴封片；包被板在室温下，用振荡器缓慢振荡孵育1.5小时，孵育结束后，用洗板机洗涤6次，拍干；洗涤完成后，向每孔中加入增强液100μl，于室温下缓慢振荡5分钟后上机检测，在30分钟内完成检测。在实际应用中，可将检测结果按规定数据进行曲线拟合分析，转入唐氏综合症风险评估软件，获得胎儿出生缺陷的发生机率。综上所述，本发明试剂盒采取镧系离子中的铕作为示踪物，利用其独特的荧光特性，如：荧光衰变时间长、激发光和发射光之间的Stokes位移较大和荧光光带窄，采用波长分辨和时间延迟技术以及解离-增强技术，可最大程度消除背景荧光的干扰，使得检测结果更加可靠，同时具有敏感性高、重复性好、特异性强、定量范围宽、检测速度快、标记物稳定等特点。下面详细阐述本发明试剂盒的性能特点。如图1所示，图1是本发明抑制素A定量检测试剂盒剂量-反应标准曲线，标注曲线的绘制具体为：将抑制素A校准品浓度值与相应反应孔测定的荧光值用LOG-LOG_B数学模型进行拟合，绘制标准曲线。在试剂盒的测量范围内，剂量-反应标准曲线线性相关系数应不低于0.9900，而图1所示，剂量-反应标准曲线线性相关系数达到0.998。如表1所示，表1为本发明试剂盒灵敏度测试，具体为，将试剂盒校准品A点重复检测20次，计算其荧光值均值和标准偏差(SD)，求得相对应的浓度值，结果不高于5.0pg/mL。表1本发明试剂盒灵敏度测试本发明试剂盒特异性测试，具体为：与108pg/ml促甲状腺激素(hTSH)的交叉反应率不高于1％；与108pg/ml黄体生成素(hLH)的交叉反应率不高于1％；与108pg/ml催乳素(PRL)的交叉反应率不高于1％；与108pg/ml绒毛膜促性腺激素(hCG)的交叉反应率不高于1％；与2×107pg/ml甲胎蛋白(hAFP)的交叉反应率不高于1％。如表2所示，表2为本发明试剂盒准确性测试，测试结果具体为：以企业校准品为对照，本发明校准品B、C点的实测浓度与标示浓度绝对偏差的绝对值均≤6pg/ml，本发明校准品D-F点的实测浓度与标示浓度相对偏差的绝对值≤20％。表2本发明试剂盒准确性测试校准点BCDEF标示值5020060010002000测定值51.61201.81598.71995.661993.91偏差1.591.840.22％0.44％0.31％如表3所示，表3为本发明试剂盒批内不精密度测试，具体为：一次实验中分别测定在标准曲线范围内高、中、低3种不同浓度的质控品，各测定20个平行孔，计算测定结果的平均值标准差(SD)，批内不精密度结果应符合批内不精密度(CV％)应不超过15.0％。表3本发明试剂盒批内不精密度测试如表4所示，表4为本发明试剂盒批间不精密度测试，具体为：用三批试剂盒分别测定低值质控品，每批试剂盒各测10孔，计算30次测定结果的平均值与标准差(SD)，批间不精密度结果应符合批间不精密度(CV％)应不超过20.0％。表4表4为本发明试剂盒批间不精密度测试如表5所示，表5为本发明校准品不精密度测试，具体为：取同一批号校准品20套，再从每套校准品(零值除外)中对各浓度校准品各取1孔(每个浓度的校准品点20孔)进行检测，计算测定结果的平均值与标准差(SD)，计算校准品瓶间标准差与校准品均一性CV。校准品中B点、C点的不精密度(CV)应不超过20.0％，D点、E点、F点的不精密度(CV)应不超过15.0％。表5本发明校准品不精密度测试如图2所示，图2是本发明抑制素A定量检测试剂盒热稳定性测试中荧光值走势图，热稳定性测试(加速破坏测试)具体为：试剂盒在37℃进行烘烤，烘烤3天，在烘烤过程中检测试剂盒的性能指标。根据图2所示数值，说明本发明试剂盒具有良好的热稳定性。如图3所示，图3是本发明抑制素A定量检测试剂盒与对照试剂盒样本检测线性相关性图，即本发明试剂盒与对照试剂盒临床样本相关性分析，具体为，检测400例孕母血清样本，两种试剂盒的线性回归方程为y＝1.0745x-11.872，R2＝0.9984。根据图3所示，本发明试剂盒与对照试剂盒的检测结果一致。其中，对照试剂盒为BECKMANCOULTER公司的抑制素A定量检测试剂盒。以上所述，本发明试剂盒线性范围宽、灵敏度高、特异性强、准确性好、精密性好、热稳定性好。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页1 2 3