苦碟子注射液指纹图谱检查方法与流程

本发明涉及一种中药注射液质量检查方法，即苦碟子注射液指纹图谱检查方法。

背景技术：

在现有技术中，苦碟子注射液（曾用名：碟脉灵注射液）列入国家药品标准产品（国药准字Z20025450），由通化华夏药业有限责任公司生产。

处方：抱茎苦荬菜1000g，制成1000ml。

含量测定：本品每10ml含总黄酮以无水芦丁（C₂₇H₃₀O₁₆）计，不得少于4.0mg。含抱茎苦荬菜以腺苷（C₁₀H₁₂N₅O₄）计，不得少于0.025mg。

功能主治：活血止痛，清热祛瘀。用于瘀血闭阻的胸痹，证见：胸闷、心痛，口苦，舌暗红或存瘀斑等。适用于冠心病、心绞痛见上述病状者。亦可用于脑梗塞者。

用法用量：静脉滴注，一次10－40ml，一日1次；用5%葡萄糖或0.9%氯化钠注射液稀释至250－500ml后应用；14天为一疗程；或遵医嘱。

规格：每支装（1）10ml，（2）20ml，（3）40ml。

中药注射剂质量的稳定、可控是临床用药安全、有效的保证。中药注射剂中化学成分具有复杂性和多样性，仅通过单个或几个化学成分的含量测定不能全面反映和控制中药注射剂的质量。这就需要建立一种合理有效的中药注射剂质量控制方法。目前，中药指纹图谱作为现代中药质量标准体系的核心技术已得到国际公认，FDA、WHO、德国、印度和日本等国家均采用指纹图谱技术作为植物药的质量控制手段。国家食品药品监督管理总局（CFDA）在中药注射剂安全性再评价指导原则中已明确要求中药注射剂必须设立指纹图谱检查项。由于目前苦碟子注射液质量标准中尚无规定指纹图谱检查项及检查方法。因此，本发明可以为苦碟子注射液指纹图谱检查提供方法，弥补质量标准的不足。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述问题与需求，而建立一种苦碟子注射液指纹图谱检查方法。

本发明的技术解决方案是：建立苦碟子注射液指纹图谱检查方法，其特征步骤如下：

1、色谱条件与系统适用性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Waters Symmetry C18 4.6 mm×250 mm，5μm；以乙腈为流动相A，0.2%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长：260nm；柱温为40℃。理论板数按木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷峰计算应不低于5000。

2、参照物溶液的制备：

取腺苷对照品、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品和菊苣酸对照品，精密称定，加25%甲醇溶液制成每1mL含腺苷5μg、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷150μg和菊苣酸60μg的混合溶液，即得。

3、供试品溶液的制备：

取苦碟子注射液，用0.45 μm滤膜滤过，即得。

4、测定法：

精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，记录75分钟内的色谱峰，即得。

苦碟子注射液中所含有的主要有效成分为腺苷、有机酸和黄酮类等成分，根据其化学性质，选择反相高效液相色谱法来进行指纹图谱分析。本发明采用的Waters Symmetry色谱柱得到的色谱峰峰形良好；流动相系统对苦碟子注射液中的主要成分有良好的洗脱和分离能力；在260nm的检测波长下，腺苷的响应值大，同时还能较为全面地检测到其他的主要成分。本发明建立的苦碟子注射液指纹图谱分析方法灵敏度高，分离度和重现性好，基线噪音小。

本发明指纹图谱中应呈现与腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三个对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰，并应出现10个共有峰，以1、2 (S)、3、4、5、6、7、8 (S)、9 (S)、10号峰为标记，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算，与对照指纹图谱相比较，相似度应不低于0.85。

图1中，峰2(S) 腺苷；峰3 尿苷；峰4鸟苷；峰5 单咖啡酰基酒石酸；峰7 木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；峰8(S) 木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰9(S) 菊苣酸；峰10 芹菜素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷。

本发明的优点是：1、本实验建立了苦碟子注射液的HPLC色谱分析方法，并进行了仪器精密度、方法重复性以及样品稳定性验证，符合指纹图谱分析方法学要求。2、本实验最终建立了苦碟子注射液在Agilent、Waters和岛津三台仪器的对照指纹图谱，各样品的匹配相似度均大于0.85，所建立的对照指纹图谱可以用于苦碟子注射液指纹图谱分析检验。3、本实验建立的苦碟子注射液对照指纹图谱能快速准确地指认出10个特征峰，较为全面地对苦碟子注射液的质量进行控制。4、本实验最终建立了苦碟子注射液的HPLC指纹图谱分析方法，灵敏度高，分离度好，色谱适用性比较强。5、本实验最终建立了重现性好的指纹图谱检测方法，较为全面地反映苦碟子注射液所含的主要化学成分，提高产品的稳定性。

附图说明

图1 苦碟子注射液对照指纹图谱。

图2 Agilent仪器10批注射液匹配色谱图。

图3 Agilent仪器样品对照指纹图谱。

图4 Agilent仪器参照物色谱指纹图谱。

图5 Waters仪器10批注射液匹配色谱图。

图6 Waters仪器样品对照指纹图谱。

图7 Waters仪器参照物色谱指纹图谱。

图8 岛津仪器10批注射液匹配色谱图。

图9岛津仪器对照指纹图谱。

图10岛津仪器参照物色谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用苦碟子注射液、相关化学原料及试剂均有市售。

实施例1

1 仪器与材料

Agilent Technologies 1200 高效液相色谱系统（含四元泵，自动进样器，柱温箱，1260 DAD检测器；美国Agilent公司）；Waters 2695高效液相液相色谱仪（含四元泵，自动进样器，柱温箱，2698DAD检测器；美国Waters公司）；岛津LC-20AT液相色谱仪（含二元泵，自动进样器，LC-20AT PDA检测器；日本岛津公司）；M320型外接柱温箱（Tianjin Puxiang）。

乙腈（Sigma公司，美国，色谱纯）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；磷酸（天津科密欧化学试剂有限公司）。腺苷、菊苣酸标准品购买于中国食品药品检定研究院，批号分别为110879-200202和111752-200902，纯度均大于98%；木犀草素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷由通化华夏药业有限责任公司提供，纯度大于98%。苦碟子注射液10批，批号分别为151108，151221，160101，160104，160106，160309，160310，160405，160411，160417。

方法与结果

2.1 溶液制备

样品溶液制备：各批次苦碟子注射液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液进样。

参照物溶液制备：取腺苷对照品、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品和菊苣酸对照品适量，精密称定，加甲醇-水（25:75）制成每1mL含腺苷5μg，木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷150μg，菊苣酸60μg的混合溶液，即得。所配制的溶液4℃保存。

色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5μm），Part No. WAT054275，Lot No.0294353071；检测波长260nm；流动相：0.2%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，洗脱梯度如表1所示，流速1.0 mL/min；进样量5μL；柱温40℃。

方法学考察

2.3.1 Agilent仪器方法学验证

1) 精密度

取“2.2项”下制备的供试品溶液，按照“2.3项”下所示的色谱条件连续进样6次，各特征峰的峰面积RSD结果见表2。

试验结果表明，RSD＜3%，精密度良好。

重复性

按“2.2项”下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.3项”下所示的色谱条件进样分析，各特征峰的峰面积RSD结果见表3。

试验结果表明，RSD＜3%，方法重复性良好。

样品稳定性

取“2.2项”下制备的供试品溶液，按照“2.3项”下所示的色谱条件在样品制备后0h，2h，4h，8h，12h，24h，进样分析，各特征峰的峰面积RSD结果见表4。

试验结果表明：RSD均小于3%，样品放置24小时稳定。

仪器方法学验证

1) 精密度

取“2.2项”下制备的供试品溶液，按照“2.3项”下所示的色谱条件连续进样6次，各特征峰的峰面积RSD结果见表5。

试验结果表明，RSD＜3%，精密度良好。

重复性

按“2.2项”下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.3项”下所示的色谱条件进样分析，各特征峰的峰面积RSD结果见表6。

试验结果表明，RSD＜3%，方法重复性良好。

）样品稳定性

取“2.2项”下制备的供试品溶液，按照“2.3项”下所示的色谱条件在样品制备后0h，2h，4h，8h，12h，24h，进样分析，各特征峰的峰面积RSD结果见表7。

试验结果表明：RSD均小于3%，样品放置24小时稳定。

岛津仪器方法学考察

1) 精密度

取“2.2项”下制备的供试品溶液，按照“2.3项”下所示的色谱条件连续进样6次，各特征峰的峰面积RSD结果见表8。

试验结果表明，RSD＜3%，精密度良好。

重复性

按“2.2项”下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.3项”下所示的色谱条件进样分析，各特征峰的峰面积RSD结果见表9。

试验结果表明，RSD＜3%，方法重复性良好。

）样品稳定性

取“2.2项”下制备的供试品溶液，按照“2.3项”下所示的色谱条件在样品制备后0h，2h，4h，8h，12h，24h，进样分析，各特征峰的峰面积RSD结果见表10。

试验结果表明：RSD均小于3%，样品放置24小时稳定。

分析及数据导出

将“2.1项”下所示的10批注射液分别按照“2.3项”下色谱方法用如“2.1项”下所示的Agilent、Waters和岛津三台液相色谱仪分析检验，通过仪器自带工作站处理并导出AIA格式色谱数据，三台仪器的积分参数设置为如下：Agilent：Slope Sensitivity（斜率灵敏度）5，Peak Width（峰宽）0.05，Area Reject（最小峰面积）1，Height Reject（最小峰高）1。Waters：阈值50，峰宽30，最小峰面积1000，最小峰高0。岛津：斜率2000，半峰宽5，最小峰面积/峰高 1000。

对照指纹图谱建立

打开中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2.0版，国家药典委员会，2010），工作模式选择生成对照，分别导入三台仪器所分析的原始数据；参照图谱参数设置分别为：参照图谱编号为S1，对照图谱生成方法为平均数法，时间窗宽度默认为0.1；在多点校正模块下选择10个共有特征峰；峰匹配方式选择Mark峰匹配；匹配完成后点击生成对照，即可得到对照指纹图谱，将所得的对照图谱保存，以备分析检验时使用。点击匹配数据和计算相似度按钮，查看并保存匹配结果。苦碟子注射液对照指纹图谱如图1所示。

仪器

按照“2.5项”下的方法建立对照指纹图谱。10批注射液匹配色谱图，对照指纹图谱如图2所示，图 2： 峰2（S）腺苷；峰3 尿苷；峰4鸟苷；峰5 单咖啡酰基酒石酸；峰7 木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；峰8（S）木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰9（S）菊苣酸；峰10 芹菜素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷。各批次注射液与对照指纹图谱的相似度见表11。参照物色谱图如图3所示。

图3中：峰2（S）腺苷；峰3 尿苷；峰4鸟苷；峰5 单咖啡酰基酒石酸；峰7 木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；峰8（S）木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰9（S）菊苣酸；峰10 芹菜素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷。

可见经Agilent仪器分析的各批次注射液指纹图谱中均出现了与腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三个参照色谱峰保留时间一致的色谱峰，并出现了10个共有峰，以1、2(S)、3、4、5、6、7、8(S)、9(S)、10号峰为标记，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算，与对照指纹图谱相比较，相似度均大于0.85。

仪器

按照“2.5项”下的方法建立对照指纹图谱。10批注射液匹配色谱图，对照指纹图谱如图4所示， 图 4 ：峰2（S）腺苷；峰3 尿苷；峰4鸟苷；峰5 单咖啡酰基酒石酸；峰7 木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；峰8（S）木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰9（S）菊苣酸；峰10 芹菜素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷。各批次注射液与对照指纹图谱的相似度见表12。参照物色谱图如图5所示。

可见经Waters仪器分析的各批次注射液指纹图谱中均出现了与腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三个参照色谱峰保留时间一致的色谱峰，并出现了10个共有峰，以1、2(S)、3、4、5、6、7、8(S)、9(S)、10号峰为标记，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算，与对照指纹图谱相比较，相似度均大于0.85。

岛津仪器

按照“2.5项”下的方法建立对照指纹图谱。10批注射液匹配色谱图如图8所示，对照指纹图谱如图9所示，各批次注射液与对照指纹图谱的相似度见表13，参照物色谱图见图10。图 9：峰2（S）腺苷；峰3 尿苷；峰4鸟苷；峰5 单咖啡酰基酒石酸；峰7 木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；峰8（S）木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰9（S）菊苣酸；峰10 芹菜素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷。

可见经岛津仪器分析的各批次注射液指纹图谱中均出现了与腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三个参照色谱峰保留时间一致的色谱峰，并出现了10个共有峰，以1、2(S)、3、4、5、6、7、8(S)、9(S)、10号峰为标记，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算，与对照指纹图谱相比较，相似度均大于0.85。

结论

本实验建立了苦碟子注射液的HPLC色谱分析方法，并进行了仪器精密度、方法重复性以及样品稳定性验证，符合指纹图谱分析方法学要求。本实验最终建立了苦碟子注射液在Agilent、Waters和岛津三台仪器的对照指纹图谱，各样品的匹配相似度均大于0.85，所建立的对照指纹图谱可以用于苦碟子注射液指纹图谱分析检验。

上面描述，只是本发明的具体实施方式，各种举例说明不对本发明的实质内容构成限制。