一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法与流程

本发明涉及一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法，属于食品安全检测领域。

背景技术：

目前致病菌的快速检测与鉴别在临床医学、食品卫生学、环境科学等领域都具有重要的研究意义。针对致病菌的检测方法有多种，包括常规使用的需细菌培养和形态特征比较的传统生化实验，该检测方法结果虽然准确但费时费力，无法为临床治疗争取时间，很难满足快速检测的需求。基于分子生物学的检测技术，如聚合酶链式反应(pcr)和酶联免疫吸附实验(elisa)技术，这些方法均能在短时间内获得结果。但pcr技术由于操作易污染，很难避免假阳性结果的产生；elisa反应中抗体之间可能产生交叉反应，且蛋白质样品保留时间短，这些弊端至今仍未克服。此外，基因芯片检测技术在本领域的应用，尽管表现出了高灵敏度和高特异性，却因为受限于成本昂贵和操作繁复，因此很难应用到实际检测中。因此，亟需一种快速、准确、灵敏度高、特异性强的检测方法。

技术实现要素：

鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法，其能解决检测过程繁琐、耗时长且成本昂贵等问题。

为了达到上述目的，本发明提供一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法，所述致病菌为大肠杆菌和福氏志贺氏菌，所述方法包括以下步骤：(ⅰ)采用上述两种致病菌的质控菌株制作拉曼增强光谱，包括利用拉曼光谱仪扫上述两种致病菌的质控菌株，以得到拉曼增强光谱，其中描拉曼光谱仪的扫描参数：激光功率为200mw，激发光波长为785nm，扫描光谱范围为400～1800cm^-1，积分时间为5-20s，分辨率为4cm^-1；(ⅱ)利用拉曼光谱仪扫待检测的食品的样品，以得到样品的拉曼光谱，其中拉曼光谱仪的扫描参数与步骤(ⅰ)一致；(iii)将实际样品的拉曼光谱与质控菌株的拉曼光谱进行比对，即根据拉曼光谱的特征峰峰位与强度进行定性识别，或者对实际样品和质控菌株的图谱中的600-1500cm-¹波段进行主成分分析与聚类分析得到拉曼光谱对应的判别散点分布图，然后比较这些判别散点分布图来判断食品中是否存在这两类致病菌；

大肠杆菌的特征峰包括646cm^-1、827cm^-1、870cm^-1、989cm^-1、1059cm^-1、1230cm^-1、1312cm^-1、1439cm^-1；

福氏志贺氏菌的特征峰包括651cm^-1、863cm^-1、979cm^-1、1010cm^-1、1166cm^-1、1242cm^-1、1340cm^-1、1446cm^-1。

在根据本发明所述的一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法中，在步骤(i)之前，还包括质控菌株样品的制备。

在根据本发明所述的一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法中，所述制备包括合成拉曼增强试剂、制备细菌培养基以及菌悬液的制备。

在根据本发明所述的一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法中，主成分分析采用的软件为spss。

合成拉曼增强试剂的具体操作过程为：取10ml氯金酸溶液至圆底烧瓶中，加热搅拌至溶液微沸，然后加入1ml浓度为2％的柠檬酸三钠溶液，继续保持微沸3min，最后将圆底烧瓶冷却，得到检测用纳米金溶胶颗粒。

制备细菌培养基的具体步骤：称取4.3mg的营养肉汤培养基于三角瓶中，加入100ml纯净水后加热溶解至溶液澄清，降温后调节ph值至7.0-7.4，在0.103mpa，121℃中灭菌15min。

配置细菌待测液的过程：将细菌或待测样品接种于培养基中，37℃，100rpm/min震荡培养5hrs，取1-5ml菌液于离心管中，4℃7000rpm/min离心5min，去除上清液加入1ml无菌生理盐水悬浮后再次离心洗涤；以上操作重复三次，得到细菌待测液。

制作拉曼光谱过程：取所述纳米金溶胶与所述细菌待测液按照(1-5)∶1混匀后，取100-500μl于样品池中，用于拉曼光谱检测。

本发明的有益效果：

建立利用表面增强拉曼光谱技术进行多种致病菌快速检测与鉴别的方法，两种致病菌的光谱图在数秒内完成；

采用sers图谱进行细菌鉴别，将检测时间缩短到几秒钟，为致病菌的快速检测提供便利方法。

附图说明

图1为两种不同致病菌的sers图谱；

图2为两种致病菌的主成分分析的散点图；

图3为实际样品的拉曼光谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案以及优点更清楚、明确，以下将结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

表面增强拉曼(surface-enhancedramanscattering，简称sers)，用通常的拉曼光谱法测定吸附在胶质金属颗粒如银、金或铜表面的样品，或吸附在这些金属片的粗糙表面上的样品。

表面增强拉曼光谱技术(sers)借助增强基底吸附在细菌细胞表面使原本的拉曼信号得到10⁶～10¹⁵倍的增强，具备更高的信噪比和灵敏度的同时，采集到更多致病菌的特征信息，显示出不同菌株间更加细微的差异。利用sers技术可检测不同的致病菌，凭借其检测图谱较低的谱带重叠和数据叠加，以及丰富的信息含量，获得“独一”的致病菌全生物指纹图谱用于识别两种致病菌；结合多元统计分析方法(multivariatestatisticalanalysis，mva)辅助结果判定，排除肉眼观察时主观判断上的误差，使致病菌的鉴别更加准确可靠。

制作两种致病菌的拉曼图谱的过程：

拉曼增强试剂的合成：吸取10ml氯金酸溶液至圆底烧瓶中，利用恒温加热磁力搅拌器加热搅拌至溶液微沸，然后加入1ml浓度为2％的柠檬酸三钠溶液，继续保持微沸3min，最后将圆底烧瓶置于冰水浴中搅拌冷却，呈酒红色，得到检测用纳米金溶胶颗粒。

培养基的配置：称取4.3mg的营养肉汤培养基于三角瓶中，加入100ml纯净水后加热溶解至溶液澄清，降温后调节ph值至7.2±0.2，0.103mpa，121℃灭菌15-20min，备用。

细菌样品的制备：将甘油保藏的菌种迅速融化，用接种环粘取接种于培养基中，37℃，100rpm/min震荡培养1-6hrs，取1ml菌液于离心管中，4℃7000rpm/min离心5min，去除上清液加入1ml无菌生理盐水悬浮后再次离心洗涤，得到待测液。

得出拉曼光谱图：采用便携式表面增强拉曼光谱仪进行检测，设置常数如下：激光功率为200mw，激发光波长为785nm，扫描光谱范围为400～1800cm^-1，积分时间为5-20s，分辨率为4cm^-1。取纳米金溶胶与样品按照(1-5)∶1混匀后，立即检测，收集拉曼光谱图(如图1所示)。图中曲线1表示的是大肠杆菌、曲线2表示的是福氏志贺氏菌。

通过sers检测发现，大肠杆菌和福氏志贺氏菌的拉曼振动峰的位置和强度区别明显，比较两种菌株的sers平均图谱，两种菌株在600-800cm^-1，900-1100cm^-1，1150-1430cm^-1波段的sers图谱存在明显差别，截取600-1500cm^-1波段进行提取主成分分析(pca)，提取出2个pc得分因子，是以累积贡献率大于70％的pc1和pc2作散点图和判别分析，模型具有较好的预测能力。用该模型辨别实验菌株，各组具有100％的灵敏度和大于94％的特异性，说明在实际检测中，该模型的低漏判率和错判率能够得到十分可靠的判别结果，可以用于大肠杆菌和福氏志贺氏菌的鉴别及区分。

在用统计分析方法研究多变量的课题时，变量个数太多就会增加课题的复杂性。人们自然希望变量个数较少而得到的信息较多。在很多情形，变量之间是有一定的相关关系的，当两个变量之间有一定相关关系时，可以解释为这两个变量反映此课题的信息有一定的重叠。主成分分析是对于原先提出的所有变量，将重复的变量(关系紧密的变量)删去多余，建立尽可能少的新变量，使得这些新变量是两两不相关的，而且这些新变量在反映课题的信息方面尽可能保持原有的信息；即设法将原来变量重新组合成一组新的互相无关的几个综合变量，同时根据实际需要从中可以取出几个较少的综合变量尽可能多地反映原来变量的信息的统计方法叫做主成分分析或称主分量分析，也是数学上用来降维的一种方法，即将相关比较密切的几个变量归在同一类中，每一类变量就成为一个因子，以较少的几个因子反映原资料的大部分信息。

累计贡献率是因子分析中抽取出的因子特征值之和和所有因子特征值之和(该值等于因子分析中的变量数)的比值。可以将其意义理解为抽取出的因子变异对所有变量变异的解释力，也可以理解为抽取出的因子对所有变量的代表性，很显然代表性高一些好，因为因子分析的目的就是化简变量，用尽量少的因子代表尽量多的变量，使变量的意义更加明确。

通过主成分分析与聚类分析，得到两种致病菌两个pc得分因子的散点图(如图2所示)，pca结果图中两个圆形(或椭圆形)内的点对应的致病菌分别为大肠杆菌和福氏志贺氏菌。

采用拉曼图谱进行实际样品的测定：

制备样品：针对固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min；或放入盛有225ml稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。针对液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。根据对样品污染状况的估计，选择原液或适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，吸取0.1-1ml样品接种于5-10ml液体培养基中，37℃100rpm/min震荡培养，待菌液变混浊后，取1-5ml菌液于离心管中，4℃7000rpm/min离心5min，去除上清液加入1ml无菌生理盐水悬浮后再次离心洗涤，得到待测液。

样品检测：采用便携式表面增强拉曼光谱仪进行检测，设置常数如下：激光功率为200mw激发光波长为785nm，扫描光谱范围为400～1800cm-1，积分时间为5-20s，分辨率为4cm^-1，取纳米金溶胶与待测样品按照(1-5)∶1混匀后，立即检测，收集拉曼光谱图。

将未知样品进行前处理，未知样品培养物未出现明显的细菌混浊，经过拉曼光谱检测，得到该样品的拉曼光谱图(见图3)，根据图3检测结果分析，该样品的特征谱峰为1370cm^-1，图谱形状与两种致病菌的指纹图谱存在明显不同，因此可以判定不属于这两类致病菌的污染。