本发明涉及除草剂检验检测技术领域，特别是涉及一种抗草甘膦转基因大豆除草剂检测液制备方法及所述的除草剂检测液中除草剂残留量的测定方法。
背景技术：
氟乐灵(trifluralin)、甲草胺(alachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、吡氟禾草灵(fluazifop-butyl)和烯禾啶(sethoxydim)是大豆田常用的除草剂，主要用于防除禾本科杂草和一些阔叶杂草，每亩的登记施用剂量均小于100g(有效成分)。以上种类除草剂可与大多数有机溶剂混溶，但由于大豆中脂肪、脂肪酸和淄醇类物质含量较高，所以净化困难。目前测定大豆中这些除草剂残留量的检测标准和方法相对比较落后，需要对几种农药分别进行检测，其中氟乐灵采用gb/t5009.172-2003《大豆、花生、豆油、花生油中的氟乐灵残留量的测定》、异丙甲草胺采用gb/t5009.174-2003《花生、大豆中异丙甲草胺残留量的测定》、吡氟禾草灵和精吡氟禾草灵采用gb/t5009.142-2003《植物性产品中吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵残留量的测定》，可见，现有技术中由于不能够同时将上述四种除草剂一次性提取，要对上述四种除草剂进行检测，就需要采用不同溶剂逐一对各种除草剂进行分别提取，然后采用气相色谱法单独对其检测。这样使得检测的工作效率大大降低。
技术实现要素：
本发明提供了一种大豆除草剂检测液制备方法及残留量的测定方法通过该法可以同时测定抗草甘膦转基因大豆中氟乐灵、甲草胺、异丙甲草胺、吡氟禾草灵、烯禾啶的残留量。
本发明提供了如下方案：
一种大豆除草剂检测液制备方法，包括：
提取：准确称取10.00g检测试样与10g硅藻土混合，移入加速萃取仪的34毫升萃取池中，在10.25～10.56兆帕压力、75～84℃条件下，加热4.5～5.5分钟；用含1％乙酸的乙腈静态萃取2.5～3.2分钟，循环2次，然后用池体积60％的乙腈冲洗萃取池，并用氮气吹扫95～106秒；萃取完毕后，将萃取液混匀，待净化；
净化：取10毫升乙腈预洗envi-18柱，然后将envi-18柱放入固定架上，下接梨形瓶，移入所述萃取液，并用15毫升乙腈洗涤envi-18柱，收集萃取液及洗涤液，取旋转蒸发器将收集的液体浓缩至约1毫升，备用；在sep-pakcarbon/nh2柱中加入2厘米高无水硫酸钠，用4毫升乙腈预洗，下接梨形瓶，放入固定架上；将上述样品浓缩液转移至双层萃取柱中，用3×2毫升乙腈洗涤样液瓶，并将洗涤液移入所述双层萃取柱中，再用25毫升乙腈洗涤所述双层萃取柱；收集上述所有流出物于梨形瓶中，并在37～42℃水浴中旋转浓缩至约0.5毫升，加入2×5毫升正己烷进行溶剂交换两次；最后加入0.02毫升内标溶液，用正己烷定容至1毫升，混匀既得所述检测液。
优选的：将检测试样采用四分法分出1千克，全部磨碎并过20目筛后，准确称取10.00g检测试样与10g硅藻土混合。
一种用于所述的除草剂检测液中除草剂残留量的测定方法，该方法包括：
取不同除草剂标准品，根据大豆中不同除草剂残留限量要求及仪器响应灵敏度，以甲苯为溶剂分别配制各个除草剂的不同浓度混合标准工作溶液，分别取0.1毫升各级混合标准工作溶液加到样品空白基质提取液中，再加入0.020毫升内标溶液，最后定容至1毫升并混匀，将混匀后的所述溶液使用气相-质谱联用仪进行测定，获得标准离子色谱图；所述标准离子色谱图中离子强度为纵坐标，时间为横坐标；
取所述检测液使用气相-质谱联用仪在一定色谱条件下进行测定，获得检测离子色谱图；
将所述检测离子色谱图与所述标准离子色谱图对比，根据预设的条件获得所述检测中除草剂种类以及含量。
优选的：取所述检测液使用气相-质谱联用仪在一定色谱条件下进行测定，所述一定色谱条件包括：
色谱柱db-1701(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管柱；载气为高纯氦气，流速1.2ml/min；进样口温度290℃；升温程序：80℃保持1min,以30℃/min升至130℃，再以5℃/min升至250℃，再以10℃/min升至300℃，保持5min，无分流进样，1.5min后打开分流阀和隔垫吹扫阀。
优选的：所述气相-质谱联用仪配备有电子轰击离子源，所述电子轰击离子源接口温度为280℃，离子源温度为230℃，电子能量为70ev，倍增器电压为1.4kv，sim方式采集数据，溶剂延迟3.5min。
优选的：所述不同除草剂标准品包括氟乐灵标准品、甲草胺标准品、异丙甲草胺标准品、吡氟禾草灵标准品以及烯禾啶标准品。
优选的：将所述检测离子色谱图与所述标准离子色谱图对比，根据预设的条件获得除草剂种类以及含量；包括：
预先确定所述离子色谱图中各个曲线峰值所在时间段对应的除草剂种类；确定所述检测离子色谱图各个曲线峰值所在时间点，根据所述时间点位于所述标准离子色谱图相应时间段所对应的除草剂标准品种类获得所述检测液中除草剂的种类。
根据本发明提供的具体实施例，本发明公开了以下技术效果：
通过本发明，可以实现一种大豆除草剂检测液制备方法及残留量的测定方法，在一种实现方式下，大豆除草剂检测液制备方法打破了现有技术中对于大豆中除草剂残留量需要每一种除草剂使用一种溶剂进行提取的方式，该方法可以一次性将多种除草剂同时提取，例如，可以同时将氟乐灵(trifluralin)、甲草胺(alachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、吡氟禾草灵(fluazifop-butyl)和烯禾啶(sethoxydim)是大豆田常用的除草剂一次性进行提取，获得的检测液可以一次性将多种除草剂进行检测。该留量的测定方法建立了气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)同时测定氟乐灵、甲草胺、异丙甲草胺、吡氟禾草灵和烯禾啶的分析方法，方法准确可靠，回收率和精密度符合残留检测要求，检测方法为检验检疫部门加强对进口转基因大豆的监管提高工作效率，也为进一步分析评估转基因大豆的食用安全性提供可利用的原始数据，同时可以为我国制定转基因大豆中相关除草剂残留限量标准提供有价值的参考资料。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例三提供的添加在空白基质中的五种除草剂混合标准物质的选择离子色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本发明实施例一提供了一种大豆除草剂检测液制备方法，该方法包括：
提取：准确称取10.00g检测试样与10g硅藻土混合，移入加速萃取仪的34毫升萃取池中，在10.25～10.56兆帕压力、75～84℃条件下，加热4.5～5.5分钟；用含1％乙酸的乙腈静态萃取2.5～3.2分钟，循环2次，然后用池体积60％的乙腈冲洗萃取池，并用氮气吹扫95～106秒；萃取完毕后，将萃取液混匀，待净化；
净化：取10毫升乙腈预洗envi-18柱，然后将envi-18柱放入固定架上，下接梨形瓶，移入所述萃取液，并用15毫升乙腈洗涤envi-18柱，收集萃取液及洗涤液，取旋转蒸发器将收集的液体浓缩至约1毫升，备用；在sep-pakcarbon/nh2柱中加入2厘米高无水硫酸钠，用4毫升乙腈预洗，下接梨形瓶，放入固定架上；将上述样品浓缩液转移至双层萃取柱中，用3×2毫升乙腈洗涤样液瓶，并将洗涤液移入所述双层萃取柱中，再用25毫升乙腈洗涤所述双层萃取柱；收集上述所有流出物于梨形瓶中，并在37～42℃水浴中旋转浓缩至约0.5毫升，加入2×5毫升正己烷进行溶剂交换两次；最后加入0.02毫升内标溶液，用正己烷定容至1毫升，混匀既得所述检测液。进一步的，将检测试样采用四分法分出1千克，全部磨碎并过20目筛后，准确称取10.00g检测试样与10g硅藻土混合。
本申请实施例一提供的方法，打破了现有技术中对于大豆中除草剂残留量需要每一种除草剂使用一种溶剂进行提取的方式，该方法可以一次性将多种除草剂同时提取，例如，可以同时将氟乐灵(trifluralin)、甲草胺(alachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、吡氟禾草灵(fluazifop-butyl)和烯禾啶(sethoxydim)是大豆田常用的除草剂一次性进行提取，获得的检测液可以一次性将多种除草剂进行检测。
实施例二
本发明实施例二提供了一种所述的除草剂检测液中除草剂残留量的测定方法该方法包括：
取不同除草剂标准品，所述不同除草剂标准品可以包括氟乐灵标准品、甲草胺标准品、异丙甲草胺标准品、吡氟禾草灵标准品以及烯禾啶标准品。根据大豆中不同除草剂残留限量要求及仪器响应灵敏度，以甲苯为溶剂分别配制各个除草剂的不同浓度混合标准工作溶液，分别取0.1毫升各级混合标准工作溶液加到样品空白基质提取液中，再加入0.020毫升内标溶液，最后定容至1毫升并混匀，将混匀后的所述溶液使用气相-质谱联用仪进行测定，获得标准离子色谱图；所述标准离子色谱图中离子强度为纵坐标，时间为横坐标；
取所述检测液使用气相-质谱联用仪在一定色谱条件下进行测定，色谱柱db-1701(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管柱；载气为高纯氦气，流速1.2ml/min；进样口温度290℃；升温程序：80℃保持1min,以30℃/min升至130℃，再以5℃/min升至250℃，再以10℃/min升至300℃，保持5min，无分流进样，1.5min后打开分流阀和隔垫吹扫阀。进一步的，所述气相-质谱联用仪配备有电子轰击离子源，所述电子轰击离子源接口温度为280℃，离子源温度为230℃，电子能量为70ev，倍增器电压为1.4kv，sim方式采集数据，溶剂延迟3.5min。获得检测离子色谱图；
将所述检测离子色谱图与所述标准离子色谱图对比，根据预设的条件获得所述检测中除草剂种类以及含量。在实际应用中，由于常用的大豆除草剂在使用气相-质谱联用仪进行检测时，由于各种除草剂的流速以及分解速度不同，因此其生成离子色谱图时出现峰值的时间不同，根据该原理本申请实施例可以提供，预先确定所述离子色谱图中各个曲线峰值所在时间段对应的除草剂种类；确定所述检测离子色谱图各个曲线峰值所在时间点，根据所述时间点位于所述标准离子色谱图相应时间段所对应的除草剂标准品种类获得所述检测液中除草剂的种类。
总之，本申请提供的除草剂残留量检测方法，该方法建立了气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)同时测定氟乐灵、甲草胺、异丙甲草胺、吡氟禾草灵和烯禾啶的分析方法，方法准确可靠，回收率和精密度符合残留检测要求，检测方法为检验检疫部门加强对进口转基因大豆的监管提高工作效率，也为进一步分析评估转基因大豆的食用安全性提供可利用的原始数据，同时可以为我国制定转基因大豆中相关除草剂残留限量标准提供有价值的参考资料。
实施例三
下面通过具体实验对本申请提供的大豆除草剂检测液制备方法及残留量的测量方法进行详细说明：
1实验部分
1.1仪器及测量条件
仪器：agilent7890a-5795c气相-质谱联用仪(配有ei源并具有选择离子功能)、加速溶剂萃取仪、旋转蒸发仪(rv-10):德国ika公司。
色谱条件：色谱柱db-1701(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管柱；载气为高纯氦气，流速1.2ml/min；进样口温度290℃；升温程序：80℃保持1min,以30℃/min升至130℃，再以5℃/min升至250℃，再以10℃/min升至300℃，保持5min，无分流进样，1.5min后打开分流阀和隔垫吹扫阀。
ms条件：电子轰击(ei)离子源：接口温度280℃，离子源温度230℃，
电子能量70ev，倍增器电压1.4kv，sim方式采集数据，溶剂延迟3.5min。
表1保留时间和监测离子
1.2试剂和材料
试剂：氟乐灵、甲草胺、异丙甲草胺、吡氟禾草灵和烯禾啶标准品均为德国dr公司，纯度>98％；内标环氧七氯甲苯溶液(浓度100μg/ml)为农业部环境保护科研检测所生产。乙腈、甲苯、正己烷为德国merck，均为色谱纯。
材料：supelcleanenvi-18柱:12ml,2g；waterssep-pakcarbon/nh2双层固相萃取柱:6ml,0.5g。
1.3试样制备及样品处理
试样制备:分别采集原产自美国、巴西、阿根廷和乌拉圭外源基因均为cp4epsps的抗草甘膦转基因大豆各3批，共12个样品，将每个样品按四分法缩分出1kg，全部磨碎并过20目筛，装入洁净的容器中，标明标记(美国：1-285、1-493、1-3745；巴西：1-635、1-1408、1-2050；阿根廷：1-1562、1-2853、1-3678；乌拉圭：1-3240、1-3502、1-3950)。
样品处理分为提取和净化，具体的操作步骤如下：
提取：准确称取10.00g试样与10g硅藻土混合，移入加速萃取仪的34ml萃取池中，在10.34mpa压力、80℃条件下，加热5min。用含1％乙酸的乙腈静态萃取3min，循环2次，然后用池体积60％的乙腈(含1％乙酸)冲洗萃取池，并用氮气吹扫100s。萃取完毕后，将萃取液混匀，待净化。
净化：用10ml乙腈预洗envi-18柱，然后将envi-18柱放入固定架上，下接梨形瓶，移入上述萃取液，并用15ml乙腈洗涤envi-18柱，收集萃取液及洗涤液，在旋转蒸发器上将收集的液体浓缩至约1ml，备用。在sep-pakcarbon/nh2柱中加入约2cm高无水硫酸钠，用4ml乙腈预洗，下接梨形瓶，放入固定架上。将上述样品浓缩液转移至双层萃取柱中，用3×2ml乙腈洗涤样液瓶，并将洗涤液移入柱中，再用25ml乙腈洗涤萃取柱。收集上述所有流出物于梨形瓶中，并在40℃水浴中旋转浓缩至约0.5ml，加入2×5ml正己烷进行溶剂交换两次。最后加入20μl内标溶液，用正己烷定容至1ml，混匀，用于气相色谱-质谱测定。
1.4标准溶液配置
根据大豆中不同除草剂残留限量要求及仪器响应灵敏度，以甲苯为溶剂分别配制不同浓度混合标准工作溶液，见表2。分别取100μl各级混合标准工作溶液加到样品空白基质提取液中，再加入20μl内标溶液，最后定容至1ml，混匀，用于气相色谱-质谱测定，制作标准曲线。
表2混合标准溶液浓度
1.5标准加入回收实验
称取不同原产国转基因大豆样品，分别进行定量下限(lqd)1、2、5倍浓度水平的添加回收实验，每个浓度水平重复6次，计算回收率和相对标准偏差。
2结果与讨论
由于大豆样品中含有很高的脂肪、脂肪酸和淄醇类物质，这些杂质是导致样品基质干扰的主要原因，易对进样口、色谱柱、离子源和四级杆造成污染，影响检测的灵敏度。本申请在保证良好回收率的前提下，通过优化提取和净化方式，降低了样品中杂质对仪器测定的干扰。
2.1提取方法的选择
高油脂样品中农药残留的提取溶剂一般为乙腈，也有报道用正己烷和丙酮提取。本申请分别以正己烷、丙酮、纯乙腈和乙腈(含1％乙酸)为提取溶剂，进行加标回收实验，加标量分别为：氟乐灵0.02mg/kg、甲草胺0.06mg/kg、异丙甲草胺0.02mg/kg、吡氟禾草灵0.02mg/kg、烯禾啶0.10mg/kg，结果见表3。结果表明经乙腈(含1％乙酸)提取所得的回收率较其他溶剂提取的高。
表3不同提取溶剂对五种除草剂提取的加标回收结果对比
2.2样品净化条件的选择
由于大豆基质复杂，样品净化先选用envi-18固相萃取柱对样品进行除油净化，再选择除色、吸附性好的sep-pakcarbon/nh2双层柱进一步分离脂肪酸、有机酸以及一些极性色素和糖类等杂质。洗脱溶剂则对比了乙腈-甲苯(3：:1)和乙腈两种的净化效果，发现用乙腈-甲苯(3：:1)洗脱时只能净化大部分的脂肪酸，对其他杂质的净化效果不明显；用乙腈洗脱时的净化效果较好。这是由于甲苯和油脂是非极性物质，大量的甲苯可将吸附的油脂洗脱下来，而强极性的乙腈对样品具有较好的洗脱净化效果，所以选择乙腈为洗脱剂。
2.3方法的标准曲线、检出限、回收率和精密度
本申请以信噪比s/n＝3确定方法的检出限(lod)，s/n＝10确定方法的定量下限(loq)。在2.0-125mg/l浓度范围内，目标除草剂的线性相关性较好，r均大于0.99，loq均小于mrl值。混合标准物质的选择离子色谱图见图1。对样品分别进行不同浓度水平的添加回收实验，其回收率和精密度的结果见表4。由表4可见，在添加loq1、2、5倍浓度水平范围内，五种除草剂回收率在77.4％-92.5％之间，精密度在4.5％～10.1％之间。本方法具有选择性好、准确度高、重复性好，能满足检测工作的实际需求。
表4样品的回收率和精密度(n＝6)
2.4样品检测
用本方法对采集的不同原产国抗草甘膦转基因大豆进行检测，未检出以上5种除草剂的残留。
3结论
可以实现气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)同时测定氟乐灵、甲草胺、异丙甲草胺、吡氟禾草灵和烯禾啶的含量，方法准确可靠，线性关系良好(r>0.99),样品加标平均回收率为77.4％-92.5％，相对标准偏差为4.5％～10.1％，定量下限0.01-0.05mg/kg，均低于目标除草剂mrl值，符合残留检测要求。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。