基于叶绿素荧光成像的转基因玉米草甘膦耐受性表型的检测方法与流程

本发明属于转基因作物的除草剂耐受性无损检测技术领域，具体涉及基于叶绿素荧光成像的转基因玉米草甘膦耐受性表型的检测方法。

背景技术：

随着现代农业的快速发展，影响农业生产发展的农田杂草得到广泛关注。研究表明，田间杂草影响农作物的品质，还会使作物的产量达到10％-100％不等的损失，严重威胁农业生产。目前，杂草的防除主要依靠喷施除草剂。草甘膦是上世纪70年代开发最为成功的一种除草剂。由于它杀草谱广且具有极好的内吸传导性能，能有效防除多年生深根恶性杂草，且对人畜安全，易分解、不污染环境，已成为目前应用最为广泛的除草剂。但由于其是非选择性除草剂，在防除杂草的同时杀死农作物，这就限制了它的使用范围和使用时间。因此培育出具有抗草甘膦特性的作物，能大大的提高除草效率降低生产成本，促进草甘膦工业的发展。

自从Comai等从鼠伤寒沙门氏菌中分离出抗草甘膦突变基因(aroA)以来，各国科研工作者对抗草甘膦转基因作物进行了广泛的研究。目前，全球已经成功研制多种抗草甘膦作物，其中玉米发展最为迅速。目前转基因耐草甘膦玉米的检测方法主要有生物测定法、生理生化法、核酸分析法、蛋白质分析法等。但这些方法对样本具有破坏性，耗费大量人力、物力，且时效性差，不利于推广应用。因此，急需一种快速无损检测技术对转基因玉米草甘膦耐受性进行检测，为转基因耐草甘膦玉米的培育提供技术支持。

有研究表明喷施草甘膦后，植物体内莽草酸含量升高，因此，莽草酸积累是植物经草甘膦处理后最早出现的且相对敏感的生理指标。叶绿素荧光成像技术能够及时探测外界胁迫对作物内部生理的细微变化，简单、快速、精确地预测玉米受到胁迫后莽草酸的含量，较好的反映玉米草甘膦的胁迫程度，对转基因玉米草甘膦耐受性表型进行评价，具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

鉴于原有生物技术检测的利弊现状，本发明提供一种基于叶绿素荧光成像的转基因玉米草甘膦耐受性表型的检测方法，应用叶绿素荧光成像技术结合化学计量学方法对转基因玉米草甘膦耐受性表型进行检测，模型预测精度较高，为转基因玉米草甘膦耐受性表型快速检测提供切实有效的检测手段

为了实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种基于叶绿素荧光成像的转基因玉米草甘膦耐受性表型的检测方法，包括：

(1)：种植同等数量的转基因玉米和非转基因玉米，在玉米生长过程中，对一部分数量的转基因玉米和非转基因玉米喷施浓度为1080g a.e.ha^-1的草甘膦溶液作为实验组，对剩余的转基因玉米和非转基因玉米喷施等量的水作为对照组；

(2)通过制定莽草酸标准曲线结合紫外分光光度法，获得受草甘膦胁迫不同天数的转基因玉米和非转基因玉米的植株冠层叶片的莽草酸含量；

(3)应用叶绿素荧光成像系统，获取受草甘膦胁迫不同天数的转基因玉米和非转基因玉米的植株冠层的荧光参数；

(4)采用主成分分析，选择对草甘膦胁迫响应最敏感的叶绿素荧光参数；

(5)通过k-means方法在实验组和对照组内选择建模集和预测集；

(6)以建模集内样本选择的叶绿素荧光参数作为输入，莽草酸含量作为输出，建立转基因玉米莽草酸PLSR回归分析模型：

(7)将预测集内样本的叶绿素荧光参数输入所述转基因玉米莽草酸PLSR回归分析模型，得到对样本的莽草酸含量。

在步骤(1)中，分别种植120盆转基因(转入cry1Ab/cry2Aj-G10evo基因)和非转基因玉米，在玉米生长至3叶期时，将浓度为1080g a.e.ha^-1的草甘膦溶液置于便携式CO2高压喷雾器中，分别对80株转基因和非转基因玉米植株进行喷施作为实验组，喷施压力为23lb pol^-2，喷施量为120L ha^-1。在同等条件下，分别对40株转基因和非转基因玉米植株喷施等量的水作为对照组。在喷施后的第2、4、6、8天各取40株株喷施草甘膦的玉米植株(转基因玉米和非转基因玉米各20株)，20株喷施水的玉米植株(转基因玉米和非转基因玉米各10株)进行实验，共有实验样本240个。

在步骤(2)中，采用紫外分光光度法结合建立莽草酸标准曲线的方法测定实验样本莽草酸含量。

(2.1)获取莽草酸提取物：每个样本取0.1g叶片加入1.5ml的0.25mol/L的HCl提取液，在冰浴状态下迅速碾磨，于12000r/min离心10min，收集离心上清液。

(2.2)测定莽草酸提取物的OD值：取200μl的离心上清液加入微量滴定板上，加入2ml浓度为1％的高碘酸，3h后，加入2ml的1mol/L的NaOH溶液，再加入1.2ml的0.1mol/L的甘氨酸，混匀后放置5min，在紫外分光光度计380nm下比色，记录OD值。

(2.3)测定莽草酸标准品的OD值并绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线：将sigma莽草酸标准品10mg溶于1.5ml的0.25mol/LHCL中，取0、1、2.5、5、10μl加入0.25mol/L HCL至1.0ml，用上述②步骤测定莽草酸标准品OD值，并绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线。其中，OD值为吸光度，实验所测的OD值是用Gen5酶标仪(美国博腾仪器有限公司生产)来测量的，通过莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线，可计算得到每个样本的莽草酸含量。

在步骤(3)中，采用开放式的FluorCam 700成像系统(PSI，Brno，Czech Republic)获取转基因玉米植株冠层的叶绿素荧光参数。该荧光成像系统由CCD(带电耦合器件)相机以12位分辨率捕获一系列512×512像素的图像。系统包括两对LED光源，其中一对提供红橙色(620nm)的光化光，强度为120μmol photons m-2s-1。另一对在800ms的白色波长(通常为500nm)中提供饱和脉冲，为强度高达1400μmol photons m-2s-1的冷白光。在测定叶绿素荧光前，被测样本需要暗适应30分钟。黑暗适应后测叶绿素荧光参数Fo和Fm，23s黑暗后，用连续光化光(120μmol photons m-2s-1)照射植物92秒，获得5个饱和脉冲。具体获得的叶绿素荧光参数如下表：

在步骤(4)中，主成分(PCA)分析是一种对数据降维的方法，其筛选出的变量既能最大程度的反映原数据代表的信息，又能保证其反映出的信息不重叠。分析结果表明，第一个主成分(PC1)能反映85％的原信息，第三个主成分(PC3)能反映6％的原信息，因此，基于PC1和PC3，可以得到对草甘膦胁迫响应最敏感的叶绿素荧光参数为Fv和Fq。

在步骤(5)中，基于转基因玉米植株叶绿素荧光参数建立PLSR模型，剔除异常样本15个，用k-means方法选择建模集样本70个，预测集样本35个。具体算法如下，随机选取K个聚类质心点(cluster centroids)为μ1，μ2，……μk,重复下面过程直到收敛:

随机选取K个聚类质心点为μ1，μ2，……μk，重复下面过程直到收敛(样例和聚类质心点都只x方向的坐标)：

对于每一个样例i，计算其应该属于的类：

c⁽ⁱ⁾＝argmin_j||x⁽ⁱ⁾-μ_j||2

其中，x⁽ⁱ⁾为第i个样例的x坐标，c⁽ⁱ⁾代表样例i与k个类中距离最近的那个类，其值是1到k中的一个。

对于每一个类j，重新计算该类的质心：

式中，μ_j为第j类的质心的x坐标。

在步骤(6)中，由于非转基因玉米植株喷施草甘膦后随时间的变化莽草酸含量变化很小，因此不对非转基因玉米植株进行建模分析。对转基因玉米植株，叶绿素荧光参数为Fv、Fq作为输入，莽草酸含量作为输出，建立PLSR回归分析模型，建模集和预测集的决定系数为R²＝0.75和0.63。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)操作简单环保，避免了传统莽草酸含量检测所需化学试剂的使用及样品制备的繁琐过程，能快速有效地监测草甘膦胁迫的转基因玉米植株莽草酸含量，为反映玉米草甘膦的胁迫程度提供有效手段，具有良好的应用前景；

(2)系统结构简单，易于操作，能够快速的获取目标植株的表型，基本实现自动化检测。

附图说明

图1是本发明基于叶绿素荧光成像技术的转基因玉米草甘膦耐受性表型检测的技术路线图。

图2是叶绿素荧光参数主成分分析结果图。

图3是本发明基于转基因玉米植株莽草酸PLSR模型的回归分析结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，进一步详细描述。本具体实施方式是以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。如图1所示，本发明以转双价基因(cry1Ab/cry2Aj-G10evo)的玉米为实施实例，其他的植物的表型可参照该实施例的方法进行。

1.制备实验样本。种植120盆转基因(转入cry1Ab/cry2Aj-G10evo基因)和非转基因玉米，在玉米生长至3叶期时，将浓度为1,080g a.e.ha^-1的草甘膦溶液置于便携式CO2高压喷雾器中，分别对80株转基因和非转基因玉米植株进行喷施作为实验组，喷施压力为23lb pol^-2，喷施量为120L ha^-1。在同等条件下，分别对40株转基因和非转基因玉米植株喷施等量的水作为对照组。在喷施后的第2、4、6、8天各取40株株喷施草甘膦的玉米植株(转基因玉米和非转基因玉米各20株)，20株喷施水的玉米植株(转基因玉米和非转基因玉米各10株)进行实验，共有实验样本240个。

2.采用紫外分光光度法结合制定莽草酸标准曲线的方法测定实验样本莽草酸含量。①获取莽草酸提取物：每个样本取0.1g叶片加入装有1.5ml的0.25mol/L的HCl提取液，在冰浴状态下迅速碾磨，于12000r/min离心10min，收集离心上清液。②测定莽草酸提取物的OD值：取200μl的离心上清液加入微量滴定板上，加入2ml浓度为1％的高碘酸，3h后，加入2ml的1mol/L的NaOH溶液，再加入1.2ml的0.1mol/L的甘氨酸，混匀后放置5min，在紫外分光光度计380nm下比色，记录OD值。③测定莽草酸标准品的OD值并绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线：将sigma莽草酸标准品10mg溶于1.5ml的0.25mol/LHCL中，取0、1、2.5、5、10μl加入0.25mol/L HCL至1.0ml，用上述②步骤测定莽草酸标准品OD值，并绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线。其中，OD值为吸光度，实验所测的OD值是用Gen5酶标仪(美国博腾仪器有限公司生产)来测量的，通过莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线，可计算得到每个样本的莽草酸含量。

3.采用开放式的FluorCam 700成像系统(PSI，Brno，Czech Republic)获取转基因玉米植株冠层的叶绿素荧光参数。该荧光成像系统由CCD(带电耦合器件)相机以12位分辨率捕获一系列512×512像素的图像。系统包括两对LED光源，其中一对提供红橙色(620nm)的光化光，强度为120μmol photons m-2s-1。另一对在800ms的白色波长(通常为500nm)中提供饱和脉冲，为强度高达1,400μmol photons m-2s-1的冷白光。在测定叶绿素荧光前，被测样本需要暗适应30分钟。黑暗适应后测叶绿素荧光参数Fo和Fm，23s黑暗后，用连续光化光(120μmol photons m-2s-1)照射植物92秒，获得5个饱和脉冲。

4.如图2所示，采用主成分(PCA)分析，选择出对草甘膦胁迫响应最敏感的叶绿素荧光参数为Fv和Fq。主成分(PCA)分析是一种对数据降维的方法，其筛选出的变量既能最大程度的反映原数据代表的信息，又能保证其反映出的信息不重叠。

5.基于转基因玉米植株叶绿素荧光参数建立PLSR模型，剔除异常样本15个，用k-means方法选择建模集样本70个，预测集样本35个。

6.如图3所示，将叶绿素荧光参数为Fv、Fq作为输入，莽草酸含量作为输出，建立PLSR回归分析模型，建模集和预测集的决定系数为R²分别为0.75和0.63。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。