高正电荷绿色荧光蛋白在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用的制作方法

本发明涉及高正电荷绿色荧光蛋白在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用，属于医学与细胞生物学技术领域。

背景技术：

肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是世界第五大常见癌症，其中约50％发生在我国，是我国第二大癌症死亡原因，严重威胁着人民的健康和生命。hcc的治疗非常困难，在早期往往没有明显症状，当症状出现时已到中晚期。因此早期诊断成为hcc治疗的关键和新的研究热点，其中寻找hcc特异性生物标志分子成为主要挑战。

目前甲胎球蛋白(afp)是被广泛用于临床的hcc分子标志物，但在hcc的早期诊断中，如果仅靠检测血清中的afp，将使直径5厘米及更小的肿瘤漏检。另外，afp水平在大量良性肝病患者血清中也显著提高，这极大地影响了其在hcc诊断中的特异性。因此，在hcc早期诊断和治疗中，急需新的更为灵敏和专一的生物标志分子。

glypican-3(gpc3)是细胞表面磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族(glypicans)的成员之一，最早由jorgefilmus教授发现鉴定。gpc3由单链核心蛋白和两条硫酸乙酰肝素(hs)侧链组成，并通过羧基末端的一个糖基磷酸化肌醇分子(gpi)锚定在细胞膜表面。在胚胎发育阶段gpc3在各种组织中广泛表达，但在成年后因dna甲基化而沉默。近年来，gpc3被发现在约75％的hcc病人中专一性表达，但在肝脏的正常组织和良性病变中不表达，因此是比afp更为特异的hcc生物标志分子。

在最近的研究中，经基因工程改造的高正电荷绿色荧光蛋白(scgfp)被开发并应用于核酸与蛋白的分析检测等方面。研究人员通过实验发现，此scgfp还可被用于糖胺聚糖的分析检测，是一种糖胺聚糖的生物相容性高灵敏荧光探针，可以与带负电荷的糖胺聚糖侧链发生强烈的电荷相互作用。

中国专利文献cn104678092a(申请号201510044900.0)公开了高正电荷绿色荧光蛋白在糖胺聚糖研究中的应用，所述高正电荷荧光蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明首次将高正电gfp作为生物相容性、高灵敏度和高选择性荧光探针，应用于活细胞表面的gags的可视化，血清中gags的高灵敏性定量分析，肝素中过硫酸化的硫酸软骨素污染分析等。扩大高正电荷绿色荧光蛋白的应用范围成为目前的研究热点。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供高正电荷绿色荧光蛋白在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用。

本发明所述技术方案如下：

高正电荷绿色荧光蛋白在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用。

根据本发明优选的，所述的所述高正电荷荧光蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

根据本发明优选的，所述带高正电荷的荧光蛋白的浓度为0.001～0.01μg/μl。

根据本发明优选的，所述肝癌早期诊断试剂盒检测的为早期肝癌标志物gpc3。

一种用于蛋白聚糖gpc3的检测试剂盒，包括：

预先固定好gpc3抗体的微孔板；

高正电荷绿色荧光蛋白，浓度0.01μg/μl；

透明质酸/硫酸软骨素降解酶；

磷酸盐缓冲液(pbs)：nacl137mm，kcl2.7mm，na2hpo410mm，kh2po42mmph7.4

以及，避光所需的锡箔纸。

上述透明质酸/硫酸软骨素降解酶、gpc3抗体为本领域普通市售产品，透明质酸/硫酸软骨素降解酶来自sigma公司,gpc3抗体来自abcam公司。

有益效果

本发明利用蛋白聚糖由核心蛋白和侧链糖胺聚糖两部分组成的特点，采用抗体与核心蛋白的专一性识别和scgfp与侧链的电荷结合作用，实现对蛋白聚糖的快速灵敏检测。基于这一原理，在本发明所底乎的试剂盒检测比传统elisa更为简单快速的荧光检测方法，可减少抗体的使用量，并且步骤简单，节约测定时间，这对于临床上通过检测病人血清中gpc3含量来对早期肝癌进行诊断具有着重要作用。

附图说明

图1、运用高正电绿色荧光蛋白检测pbs中早期肝癌标志物gpc3；

图2、运用高正电绿色荧光蛋白检测血清中早期肝癌标志物gpc3；

图3、盐浓度对血清中gpc3检测的影响；

图4、酶预处理对血清中gpc3检测的影响；

图5、运用高正电绿色荧光蛋白检测肝癌病人及正常人、良性肝病病人早期肝癌标志物gpc3。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步的阐述，其是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。

按照中国专利文献cn104678092a(申请号201510044900.0)中公开的技术方案合成高正电荷绿色荧光蛋白，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

实施例1、用高正电绿色荧光蛋白检测pbs中不同浓度的gpc3。

使用gpc3抗体(购自abcam公司，30ng/ml)60μl铺于384微孔白板上，并用1％bsa对其进行封闭。封闭结束后用pbs清洗3次，然后加入溶在pbs中不同浓度的gpc3和gpc3δgag(无糖胺聚糖侧链的gpc3)，室温放置2小时，孵育结束后，用pbs洗涤3次，加入0.3μg高正电荷绿色荧光蛋白(scgfp)，室温避光放置10min，pbs洗涤5次，测定荧光强度(ex：470nm，em：509nm)。结果显示，随着gpc3和gpc3δgag含量的增加，荧光强度也增加；在同浓度时，gpc3比gpc3δgag结合荧光的能力更强(如图1所示)。这说明，gpc3的糖胺聚糖侧链在荧光结合过程中起着重要的作用，并且由此建立了一种比传统方法更为简便快捷的gpc3检测方法。

实施例2、用高正电绿色荧光蛋白检测血清中不同浓度的gpc3。

如上所述，将gpc3的专一性抗体铺板于384微孔白板中，并进行封闭。然后加入溶解在适当稀释的胎牛血清中的gpc3和gpc3δgag，室温放置2小时，孵育结束后，用pbs洗涤3次，加入0.3μgscgfp，室温避光放置10min，pbs洗涤5次，测定荧光强度(ex：470nm，em：509nm)。结果显示，随着gpc3和gpc3δgag含量的增加，荧光强度也增加；在同浓度时，gpc3比gpc3δgag结合荧光的能力更强；但是相对于在pbs中灵敏度低了一些(如图2所示)。这说明，高正电绿色荧光蛋白可以检测血清中的gpc3，为临床中肝癌的早期诊断提供了一种简便快捷的方法。

实施例3、盐浓度对血清中gpc3检测的影响

将含有gpc3的胎牛血清中加入不同浓度的nacl，在30℃孵育1小时，间或温和震荡，然后以实施例2中的方法检测盐浓度对血清中gpc3检测的影响。结果显示与不加nacl相比，0.5mnacl可以显著提高检测样品的荧光强度(如图3所示)。

实施例4、酶处理处理对血清中gpc3检测的影响

在确定最佳盐浓度后，将含有gpc3的血清用透明质酸/硫酸软骨素降解酶在最佳盐浓度下于30℃预处理1小时，然后以实施例2中的方法检测酶预处理对血清中gpc3检测的影响。结果显示，酶处理后荧光相对强度明显增强(如图4所示)。

实施例5、临床血清中gpc3的比较分析

将临床血清样本(正常组、良性肝病组、hcc组，均由齐鲁医院提供)用含有一定浓度nacl的pbs适当稀释，在最佳盐浓度下用hclase于30℃预处理1小时，然后用实施例2中的方法检测各样本的荧光强度并分析比较。结果显示，相对于正常人与良性肝病病人血清来说，肝癌病人血清恢复荧光的能力更强(如图5所示)。这说明，高正电绿色荧光蛋白可以应用于临床肝癌病人的早期诊断。

实施例6、一种用于蛋白聚糖gpc3的快速灵敏检测试剂盒，包括：

预先固定好gpc3抗体的微孔板；

高正电荷绿色荧光蛋白，其浓度为0.01μg/μl；其制备方法为本领域常规技术，可参考文献lawrence,m.s.；phillips,k.j.；liu,d.r.j.am.chem.soc.2007,129,10110-10112.中的构建表达方法；

透明质酸/硫酸软骨素降解酶；

缓冲液：磷酸盐缓冲液(pbs)；

以及，避光所需的锡箔纸。

说明书中涉及的参考文献

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