本发明属于药物分析领域,具体涉及一种普拉康唑光学异构体的分析检测方法。
背景技术:
普拉康唑(pramiconazole,sr型),化学名1-(4-{4-[4-({(2s,4r)-4-(2,4-二氟苯基)-4-[(1h-1,2,4-三唑-1-基)甲基]-1,3-二氧戊环-2-基}甲氧基)苯基]哌嗪-1-基}苯基)-3-(丙烷-2-基)咪唑烷酮-2-烷,是由比利时barriertherapeutics公司开发研制的一种新型三唑类抗真菌药,目前在欧盟尚处于ⅱa期临床试验阶段,尚未上市,具有疗效确切,耐受性好,不良反应程度较轻的特点,是一种较有发展前途的广谱抗真菌药。
普拉康唑结构中有2个手性碳,在合成过程中可能会产生4种光学异构体,除了目标化合物普拉康唑sr型外,还有rs型异构体、rr型异构体和ss型异构体。按照研发立体异构体新药的相关技术要求,有必要建立一套完善的分析方法对普拉康唑的光学异构体杂质进行质量控制和产品质量评价。各异构体化学结构式如下所示:
郑曦孜提供了一种普拉康唑中四种光学异构体的hplc测定方法(中国医药导报,2016年4月),但是该方法采用的是手性色谱柱(daicelchiralpakic手性柱)。众所周知,手性色谱柱较为昂贵,且使用寿命短,使用手性色谱柱开发的液相分析方法具有较高的应用成本。
技术实现要素:
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种基于普通c18色谱柱测定普拉康唑中四种光学异构体的液相分析方法,以降低色谱耗材支出,节约研发经费。
本发明通过下面的技术方案得以实现:
一种普拉康唑光学异构体的分析检测方法,采用液相色谱法,液相色谱法的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶,流动相为乙腈水溶液,乙腈体积百分浓度为30-50%,该乙腈水溶液中含有有效浓度的4-叔丁基环己醇,且4-叔丁基环己醇为顺反异构体混合物。
优选地,所述流动相中,4-叔丁基环己醇的有效浓度指质量体积浓度为1-2g/l。
优选地,所述的分析检测方法包括如下色谱参数:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶(c18)色谱柱;
流动相a相:30%乙腈水溶液,4-叔丁基环己醇的质量体积浓度为1.5g/l;
流动相b相:50%乙腈水溶液,4-叔丁基环己醇的质量体积浓度为1.5g/l;
洗脱程序:0-3min,0%b相;3-5min,0%→50%b相;5-10min,50%b相;
流速:0.8-1.2ml/min;
柱温:28-32℃;
检测波长:208-212nm。
优选地,流速为1.0ml/min。
优选地,柱温为30℃。
优选地,检测波长为210nm。
优选地,十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为长250mm、内径4.6mm、填料粒径5μm。
优选地,所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱优选thermoscientifictmacclaimtm120c18。
本发明的优点:
使用本发明提供的方法在普通c18色谱柱上即可实现普拉康唑光学异构体的有效分离,应用成本显著降低,可以节省大量色谱柱耗材费用。
附图说明
图1为普拉康唑四种光学异构体的化学结构式比较;
图2为普拉康唑四种光学异构体混合对照品溶液的hplc色谱图;
图3为供试品溶液在本发明色谱条件下的色谱图;
图4为混合对照品溶液在对比色谱条件下的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步介绍本发明的技术方案。
实施例1普拉康唑光学异构体的分离和测定
一、实验材料
岛津lc-20a高效液相色谱仪;
cpa225d电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);
色谱柱:thermoscientifictmacclaimtm120c18;
普拉康唑原料药自制,普拉康唑、rs型异构体、rr型异构体和ss型异构体对照品自制(纯度大于98.5%),普拉康唑及其异构体的化学结构式如图1所示;
4-叔丁基环己醇(cas号98-52-2,顺反异构体混合物,百灵威科技,产品编号107223);
乙腈为色谱纯,水为去离子水,其余试剂均为分析纯。
二、实验方法和结果
1、溶液配制
对照品和供试品稀释液:30%乙腈水溶液,4-叔丁基环己醇的质量体积浓度为1.5g/l。
对照品溶液:分别精密称取普拉康唑4种异构体标准品各约10mg,各置于100ml量瓶中,加上述稀释液溶解并定容至刻度,摇匀,作为浓度为100μg/ml的对照品溶液。
混合对照品溶液:将4种异构体对照品溶液等体积混合,配制成4种异构体浓度分别约为25μg/ml的混合对照品溶液。
供试品溶液:精密称取普拉康唑样品100mg,置于100ml量瓶中,加上述稀释液溶解并定容至刻度,摇匀,作为浓度为1mg/ml的供试品溶液。
2、色谱条件
色谱柱:thermoscientifictmacclaimtm120c18;
流动相a相:30%乙腈水溶液,4-叔丁基环己醇的质量体积浓度为1.5g/l;
流动相b相:50%乙腈水溶液,4-叔丁基环己醇的质量体积浓度为1.5g/l;
洗脱程序:0-3min,0%b相;3-5min,0%→50%b相;5-10min,50%b相;
流速:1.0ml/min;
柱温:30℃;
检测波长:210nm。
3、分离度考察
取普拉康唑4种异构体对照品溶液、混合对照品溶液,分别进样测定,结果表明,4种异构体的出峰顺序依次为rr型异构体、sr型异构体、rs型异构体、ss异构体型,普拉康唑及其光学异构体基线达到完全分离,分离度均大于1.5,理论板数均大于10000,拖尾因子均小于1.15,溶剂峰不干扰测定。色谱图见图2。
4、线性试验
分别精密称取4种异构体对照品适量,加稀释液溶解并摇匀稀释,配制成约0.5、5、10、20、50、80、100、120μg/ml的系列浓度溶液,进样测定,以峰面积对浓度作图,进行线性回归,分别得到4种异构体的回归方程,线性关系良好,r2>0.9998。
5、灵敏度考察
精密称取4种异构体对照品各适量,加稀释液溶解并稀释至4种异构体峰高约为基线噪音的3倍。结果各异构体的最低检出限均约为1.2×10-3μg,灵敏度高。
6、加样回收率试验
按常规方法配制回收率测定溶液,计算各异构体的回收率,结果证明普拉康唑4种异构体的回收率均在98-102%之间(rsd<1.5%,n=3),符合要求。
7、精密度和稳定性试验
取上述混合对照品溶液和供试品溶液,分别连续进样6次,记录色谱图。结果rsd均小于2.0%(n=6),表明本方法精密度良好。
分别取上述混合对照品溶液和供试品溶液,于室温放置,分别于0、4、8、12、24h进样测定,记录色谱图。结果普拉康唑4种异构体的峰面积在24h内的rsd均小于2.0%(n=5),表明混合对照品溶液室温放置24h稳定。
8、原料中异构体含量测定
取样品适量,按上述方法制备混合对照品溶液和供试品溶液,分别进样测定,记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与混合对照品溶液色谱图中各异构体保留时间相同的杂质峰,按外标法以峰面积计算各异构体的含量。供试品溶液色谱图如图3所示。
rr型异构体在三批样品中的含量分别为0.02%、0.03%、0.02%;
rs型异构体在三批样品中的含量分别为0.03%、0.02%、0.02%;
ss型异构体在三批样品中的含量分别为0.03%、0.02%、0.03%。
实施例2对比实施例,使用普通的乙腈水洗脱
一、实验材料
岛津lc-20a高效液相色谱仪;
cpa225d电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);
色谱柱:thermoscientifictmacclaimtm120c18;
普拉康唑原料药自制,普拉康唑、rs型异构体、rr型异构体和ss型异构体对照品自制(纯度大于98.5%),普拉康唑及其异构体的化学结构式如图1所示;
乙腈为色谱纯,水为去离子水,其余试剂均为分析纯。
二、实验方法和结果
1、溶液配制
对照品和供试品稀释液:30%乙腈水溶液。
对照品溶液:分别精密称取普拉康唑4种异构体标准品各约10mg,各置于100ml量瓶中,加上述稀释液溶解并定容至刻度,摇匀,作为浓度为100μg/ml的对照品溶液。
混合对照品溶液:将4种异构体对照品溶液等体积混合,配制成4种异构体浓度分别约为25μg/ml的混合对照品溶液。
2、色谱条件
色谱柱:thermoscientifictmacclaimtm120c18;
流动相a相:30%乙腈水溶液;
流动相b相:50%乙腈水溶液;
洗脱程序:0-3min,0%b相;3-5min,0%→50%b相;5-10min,50%b相;
流速:1.0ml/min;
柱温:30℃;
检测波长:210nm。
3、分离度考察
取普拉康唑混合对照品溶液进样测定,结果4种异构体在该色谱条件下无法实现两两分离。混合对照品溶液在该色谱条件下的色谱图见图4。
使用本发明提供的方法在普通c18色谱柱上即可实现普拉康唑光学异构体的有效分离,应用成本显著降低,可以节省大量色谱柱耗材费用。