一种基于纳米复合材料的血红蛋白电化学传感器的制备及应用的制作方法

本发明涉及一种基于纳米复合材料的血红蛋白电化学传感器(nafion/hb/rgo@fe3o4/cile)的制备方法及应用，涉及电化学生物传感器和修饰电极电化学分析领域。

背景技术：

以无媒介体的氧化还原蛋白质和酶的直接电化学行为为基础，利用酶与电极之间的直接电子转移为检测特征的第三代电化学生物传感器，因其制作过程简单，灵敏度高，检测范围广，检测限低等优点，成为当前最理想的生物传感器，并广泛应用于电化学与电分析化学研究。血红蛋白(hemoglobin，hb)是一类主要存在于脊椎动物中的近似球形的氧化还原蛋白质，在高等生物体内承担着储存和运输氧的重要任务。hb分子中存在一对氧化还原电对(fe³⁺/fe²⁺)，当铁原子呈二价时，称之为亚铁血红蛋白，可与氧可逆结合，当铁原子呈三价时，则称之为高铁血红蛋白，不具有结合氧的能力。通过研究hb在修饰电极复合膜内的直接电化学行为，可以揭示出生物体内的氧化还原反应机理及其电子转移过程。但由于氧化还原蛋白质的电活性中心被深埋在其结构内部，很难与电极发生直接的电子传递，从而影响其直接电化学行为。因此，多种化学修饰电极被用来提高电极表面电子转移速率。

纳米材料具有高比表面积、优良的生物相容性以及高表面自由能等独特性质，在化学催化、生物医药、电子信息等方面具有广阔的应用前景。氧化石墨烯(grapheneoxide，go)，具有与石墨烯(graphene，gr)相似的空间结构，其表面分布着不同种类的含氧官能团，具有比表面积大、在水中的分散性好和表面官能团丰富等优点。通过溶剂热还原法、高温热还原法和化学还原法等不同的方法可将其还原制成还原氧化石墨烯(reducedgrapheneoxide，rgo)，使其电化学性能得以大幅度提升，此外，还能够与其他材料形成的纳米复合材料，发挥良好的协同作用。

本发明构建了一种基于纳米复合材料的血红蛋白电化学传感器，克服了前两代酶传感器线性范围窄、受测定体系限制、制作电极过程复杂、介体材料易污染等诸多缺点。本发明以离子液体碳糊电极(cile)为基底电极，以氧化还原石墨烯-四氧化三铁(rgo@fe3o4)纳米复合材料为电子转移促进剂，采用分层滴涂法分别将rgo@fe3o4纳米复合材料和hb修饰在cile表面，最后滴涂nafion固定制得相应的修饰电极(nafion/hb/rgo@fe3o4/cile)。通过多种电化学方法对该修饰电极进行表征分析，并将该修饰电极成功地应用于tca和nano2含量的快速测定。

技术实现要素：

本发明涉及一种基于纳米复合材料的血红蛋白电化学传感器(nafion/hb/rgo@fe3o4/cile)的制备方法及应用。

血红蛋白电化学传感器nafion/hb/rgo@fe3o4/cile的制备方法，其特征在于以下步骤：

(1)离子液体碳糊电极(cile)的制备：称取质量比为2:1的石墨粉和离子液体hppf6，于研钵中混合研磨均匀，将研磨好的碳糊填入玻璃电极管中，插入铜丝作为导线，将固体混合物压实即得cile，使用前将电极表面打磨成光滑镜面；

(2)血红蛋白电化学传感器nafion/hb/rgo@fe3o4/cile的制备：配制一定浓度的rgo@fe3o4溶液，超声分散均匀，取4~10μl滴涂在cile表面，室温自然晾干后再滴涂6~10μl一定浓度hb溶液，并于室温自然晾干，最后滴涂4~10μl0.5%nafion溶液加以固定，室温晾干后即得修饰电极nafion/hb/rgo@fe3o4/cile；

(3)修饰电极应用于三氯乙酸(tca)和亚硝酸钠(nano2)的电化学检测：以chi660d型电化学工作站(上海辰华仪器公司)为测试仪器，以nafion/hb/rgo@fe3o4/cile为工作电极，饱和甘汞电极(sce)为参比电极，铂电极为辅助电极组成三电极系统，并置于经30min通n2除氧的ph3.0pbs中；研究tca和nano2在修饰电极nafion/hb/rgo@fe3o4/cile上的电化学行为，扫描速度为100mv/s。实验结果表明该修饰电极对tca和nano2有较强的电催化活性，能够快速响应并具有较低的检测限。

本发明的有益效果是：提出了一种基于rgo@fe3o4纳米复合材料的血红蛋白电化学传感器(nafion/hb/rgo@fe3o4/cile)的制备方法。所述修饰电极制备方法简单，选择性好，电化学窗口宽，表面易于更新，导电性能和生物相容性好。实验结果表明修饰电极nafion/hb/rgo@fe3o4/cile能够应用于tca和nano2的快速电催化检测，具有操作简单，催化活性高，灵敏度高等诸多优点。

附图说明

图1为rgo@fe3o4纳米复合材料的扫描电子显微镜图。

图2为不同修饰电极(a)rgo@fe3o4/cile，(b)nafion/hb/rgo@fe3o4/cile，(c)cile，(d)nafion/cile，(e)nafion/hb/cile分别在0.1mol/lkcl和10.0mmol/lk3[fe(cn)6]混合溶液中的电化学交流阻抗图。

图3为不同修饰电极(a)nafion/hb/rgo@fe3o4/cile，(b)nafion/hb/cile，(c)nafion/rgo@fe3o4/cile，(d)nafion/cile分别在ph3.0pbs中的循环伏安曲线。

图4为修饰电极nafion/hb/rgo@fe3o4/cile在不同扫描速度下的循环伏安图(曲线a到q分别为10，50，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800mv/s)。

图5(a)为修饰电极nafion/hb/rgo@fe3o4/cile在不同tca浓度下的循环伏安曲线图(曲线a到r依次为0，5，10，20，30，40，50，60，70，80，100，130，160，190，220，250，280，310mmol/ltca)，(b)为催化还原峰电流ipc与tca浓度之间的关系曲线。

图6(a)为修饰电极nafion/hb/rgo@fe3o4/cile在不同nano2浓度下的循环伏安曲线图(曲线a到q依次为0，0.04，0.06，0.14，0.20，0.26，0.32，0.38，0.45，0.55，0.65，0.75，0.95，1.10，1.40，1.60，1.80mmol/lnano2)，(b)为催化还原峰电流ipc与nano2浓度之间的关系曲线。

附图说明

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例1

图1为rgo@fe3o4纳米复合材料扫描电子显微镜图，不同放大倍数的纳米复合材料扫描电镜显示，球形的fe3o4纳米颗粒均匀分散在卷曲且具有褶皱结构的还原氧化石墨烯(rgo)层片上，使复合材料具有较大的比表面积。

实施例2

离子液体碳糊电极(cile)的制备：称取1.6g石墨粉和0.8g离子液体hppf6放入研钵混合并研磨均匀，把磨好的碳糊填入内径为4mm的洁净玻璃电极管中，插入铜丝作为导线，并将固体混合物压实，即得离子液体碳糊电极(cile)，使用前将电极表面打磨成光滑镜面。

实施例3

nafion/hb/rgo@fe3o4/cile电极的制备：分别配制浓度为1.5mg/mlrgo@fe3o4纳米复合材料溶液和15.0mg/mlhb溶液，取6.0μlrgo@fe3o4溶液滴涂在cile表面，室温晾干后，再滴涂8.0μlhb溶液，室温晾干后滴涂6.0μl0.5%nafion溶液成膜固定，室温晾干后即得nafion/hb/rgo@fe3o4/cile修饰电极。

实施例4

图2所示为不同修饰电极分别在0.1mol/lkcl和10.0mmol/lk3[fe(cn)6]混合溶液中的电化学交流阻抗图。在rgo@fe3o4/cile(曲线a)上为一条直线，电阻值为0ω，在其它电极上的电阻值分别为：nafion/hb/rgo@fe3o4/cile(曲线b)电阻值42ω，cile(曲线c)电阻值137ω，nafion/cile(曲线d)电阻值178ω，nafion/hb/cile(曲线e)电阻值230ω。实验结果说明电极表面修饰的nafion和hb分子，因其不导电而阻碍了[fe(cn)6]^3-/4-的电子转移，使界面阻值增大，而rgo@fe3o4纳米复合材料具有良好的导电性，加速与电极间的电子传递，使阻值变小，有效地促进了电化学反应。当它们分别或共同存在时，表现出不同的界面电阻效果。

实施例5

图3所示为不同修饰电极在ph=3.0pbs缓冲溶液中的循环伏安曲线，nafion/rgo@fe3o4/cile(曲线c)和nafion/cile(曲线d)均没有出现氧化还原特征峰，说明电极表面不存在电活性物质。nafion/hb/cile(曲线b)上出现了一对明显的氧化还原峰，说明hb和cile之间存在电子转移，可以发生直接电化学反应。而在nafion/hb/rgo@fe3o4/cile(曲线a)上呈现出一对对称性良好的准可逆氧化还原峰，且峰电流显著增大，说明rgo@fe3o4纳米复合材料的存在增大了电极比表面积，其良好的导电性加速了hb分子与电极间的电子传递，提高了电子转移速率。nafion/hb/rgo@fe3o4/cile(曲线a)上氧化峰和还原峰电位分别为epa=-0.166v(vs.sce)和epc=-0.234v(vs.sce)，峰电位差△ep=68mv，式电位e⁰′=-0.200v(vs.sce)，表现出hb大分子电活性中心血红素辅基fe(iii)/fe(ii)电化学特征。

实施例6

图4所示为修饰电极nafion/hb/rgo@fe3o4/cile在10~800mv/s扫速范围内的电化学行为，出现一对峰形良好的氧化还原峰，氧化还原峰电流(ip)与扫描速度成正比，线性回归方程分别为ipc(µa)=130.164v(v/s)+1.125(n=16，r=0.992)和ipa(µa)=-117.997v(v/s)-7.024(n=16，r=0.993)，说明此扫速范围内电化学行为属于薄层电化学行为，是吸附控制过程。随着扫速的增加，峰电位发生偏移，峰电位差逐渐增大，epc(v)=-0.0286lnv(v/s)-0.261(n=8，r=0.995)和epa(v)=0.0225lnv(v/s)-0.108(n=8，r=0.998)。根据laviron理论，推导出电子转移数n=1.14，电子传递系数α=0.78，反应速率常数ks=1.30s^-1。实验结果说明具有高比表面积的rgo@fe3o4纳米复合材料为hb提供了良好的电荷转移通道，加快了hb与基底电极间的电子转移。

实施例7

以nafion/hb/rgo@fe3o4/cile为工作电极，饱和甘汞电极(sce)为参比电极，铂电极为对电极，组成的三电极系统置于含有不同浓度tca的ph=3.0pbs缓冲溶液中，采用chi660d型电化学工作站进行电化学测试，电化学窗口范围为+0.3v~-0.8v(vs.sce)，循环伏安扫描结果如图5a所示，随着tca浓度的增加，还原峰电流ipc逐渐增加，且在-0.283v出现一个新的还原峰，而氧化峰电流则逐渐减小直至消失。当tca浓度在5.0~310.0mmol/l范围内时，ipc与tca浓度呈良好的线性关系(如图5b)，线性回归方程为ip(µa)=2.68c(mmol/l)+158.04(n=12，r=0.992)，检测限为1.67mmol/l，说明修饰电极对tca表现出良好电催化效果。

实施例8

同样的三电极系统置于含有不同浓度nano2的ph=3.0pbs缓冲溶液中，循环伏安扫描结果如图6a所示，随着nano2浓度的增加，还原峰电流ipc逐渐增加，且在-0.617v左右出现一个新的还原峰，而氧化峰电流则逐渐减小直至消失。当nano2浓度在0.04~1.80mmol/l范围内时，ipc与nano2浓度呈良好的线性关系(如图6b)，线性回归方程为ip(µa)=88.61c(mmol/l)+24.91(n=13，r=0.992)，检测限为13.33µmol/l。