本发明涉及一种头孢菌渣中头孢菌素C残留效价的测定方法，具体涉及一种头孢菌渣中头孢菌素C残留效价的高效液相色谱测定方法。
背景技术：
：我国是头孢菌素的生产大国，头孢发酵菌渣是在发酵生产头孢菌素C提取后产生的废弃物，产生量非常巨大，菌渣中头孢菌素C的残留，将会导致畜禽和生态环境微生物的耐药性，从而对人类健康产生潜在的耐药风险，因此，我国明确规定头孢菌渣不能直接用作饲料和肥料并将其列入危险废弃物。头孢菌素C的结构与青霉素相似，具有一内酞胺环，母核均为一氨基头孢烷酸，分子式为C15H21N3O8S，分子量为415.42，结构式如下：被检(监)测的标的物固体物为钠盐二水无色晶体，易溶于水，不溶于乙醇、乙醚。稳定性较差。迄今为止，国内外尚没有一种检测头孢菌渣中头孢菌素C残留效价的标准方法，故不能准确的检测头孢菌渣中残留头孢菌素C的含量，无法确定其对环境可能的危害和影响，严重的制约了菌渣的资源化再利用，因此建立头孢菌渣中头孢菌素C残留效价测定方法，明确判断与放行标准，排除头孢菌渣中头孢菌素C残留对环境可能带来的负面影响，显得十分必要且具有极其重大的现实意义，可以为解决头孢菌渣处理处置提供理论依据。技术实现要素：头孢菌渣中头孢菌素C残留效价较低，而且菌渣机质复杂，干扰物较多，因此，需要对待测物进行有效的提取分离，最大程度减小检测误差，以保证检测结果的准确性。因此，本发明提供了一种头孢菌渣中头孢菌素C残留效价的测定方法，基于头孢菌素C的特性，采用磷酸盐缓冲溶液对菌渣进行提取，降低复杂基质对目标分析物的干扰，提高检测结果的准确度。本发明提供了一种头孢菌渣中头孢菌素C残留效价的测定方法，它包括如下步骤：(1)供试品溶液：取头孢菌渣，研磨，用磷酸盐缓冲溶液对其进行提取，离心，取上清液作为供试品溶液；(2)对照品溶液：将头孢菌素C钠盐标准品溶于流动相A中，即得对照品溶液；所述流动相A为醋酸钠缓冲溶液或醋酸铵缓冲溶液；(3)测定残留效价：取待测液，利用高效液相色谱法测定峰面积，根据对照品和供试品的峰面积计算得到头孢菌素C残留效价；所述高效液相色谱法的色谱条件为：流动相由流动相A和流动相B组成，其中流动相B为乙腈，流动相A与流动相B的体积比为97:3～99:1；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱。步骤(1)中，所述头孢菌渣为喷雾干燥灭活的头孢菌渣固体或头孢菌渣液体；所述头孢菌渣固体研磨后的粒径为D97≤300μm；所述头孢菌渣液体研磨后的粒径为D97≤50μm。优选地，所述头孢菌渣固体与磷酸盐缓冲液的质量体积比为0.5～3：10～40g/ml；优选为1:20g/ml；所述头孢菌渣液体与磷酸盐缓冲液的质量体积比为3～5：10～40g/ml；优选为1:5g/ml。步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol/L～0.2mol/L，优选为0.1mol/L；所述磷酸盐缓冲溶液的pH为3.0～8.0；优选为3.0～5.5；更优选为5.0。步骤(1)中，所述提取为超声提取；所述超声提取的频率为40KHz；所述超声提取的时间为20～50min，优选为30min。步骤(1)中，所述离心时的转速为3500～6000rpm，优选为4500rpm；所述离心的时间为5～30min，优选为10min。步骤(2)中，所述对照品溶液的浓度为0.25mg/mL。步骤(2)中，所述流动相A的浓度为0.01mol/L～0.05mol/L，优选为0.01mol/L；所述流动相A的pH为3.55～6.55，优选为4.75。步骤(3)中，所述高效液相色谱的测定条件：流动相A与流动相B的体积比为98：2；流速为0.8ml/min～1.2ml/min，优选为1.0ml/min；柱温为25℃～40℃，优选为30℃；检测波长为254nm；进样量10μl。步骤(3)中，所述头孢菌素C残留效价是通过下式计算得到：式中：X—样品中头孢菌素C残留效价，μg/g；m对—对照品的质量，mg；m样—样品质量，g；P—对照品中头孢菌C的百分含量，％；A对—对照品的峰面积；A样—样品的峰面积；D样—样品的稀释倍数；100—对照品的稀释倍数；1000—单位换算系数。本发明利用高效液相色谱法测定头孢菌渣中头孢菌素C残留效价，本发明检测方法具有灵敏度高、分离效率高、选择性好、复性好、准确度高的优点，检测限可达0.0085μg/ml，定量限可达0.0425μg/ml。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为实施例1中FBS-170730106批头孢菌素C残留效价图谱；图2为实施例1中FBS-170730107批头孢菌素C残留效价图谱；图3为实施例1中FBS-170730108批头孢菌素C残留效价图谱；图4为实验例2中头孢菌素C残留效价测定方法检测限及定量限图谱；图5为实验例3中头孢菌素C对照品图谱；图6为实验例3中250mg/kg的加标浓度头孢菌素C回收率图谱。具体实施方式本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。1)材料与试剂头孢菌素C钠盐(美国QCC集团)磷酸氢二钠：级别：AR厂家：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠：级别：AR厂家：国药集团化学试剂有限公司；醋酸钠：级别：AR厂家：国药集团化学试剂有限公司；醋酸铵：级别：AR厂家：国药集团化学试剂有限公司；乙腈：级别：HPLC厂家：国药集团化学试剂有限公司；磷酸：级别：AR厂家：天津市北联精细化学品开发有限公司；冰乙酸：级别：AR厂家：天津永晟精细化工有限公司。2)主要仪器超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；高效液相色谱仪Agilent1260(安捷伦科技有限公司)；色谱柱(型号：X-Bridge规格：4.6*250mm*5um厂家：沃特世科技有限公司)；容量瓶(规格：100ml、1000ml厂家：天津市天科玻璃仪器制造有限公司)。实施例1喷雾干燥灭活头孢菌渣中头孢菌素C残留效价测定1)缓冲液的配制0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.0)：称取17.9g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)(分析纯)溶解到500ml纯化水中，用磷酸(分析纯)调节pH至5.0。0.01mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.75)：称取0.4g氢氧化钠(分析纯)，用少量纯化水溶解后转移至1000ml容量瓶中，再准确量取1ml冰乙酸(分析纯)加入到容量瓶中，用纯化水定容至刻度，摇匀，用冰乙酸(分析纯)调节pH至4.75。2)头孢菌渣的提取分离取喷雾干燥灭活的固体头孢菌渣样，使用中等力度用研磨钵研磨300圈以上，研磨至细腻均一的粉状，使其粉末粒度为D97＝218.01μm；称取喷雾灭活头孢菌渣研磨样1g，于50ml聚丙烯离心管中，加入20ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.0)，涡旋振荡1min，超声辅助提取30min，以4500rpm离心10min，取上清液。3)头孢菌素C残留效价检测a、色谱条件色谱柱为WatersX-BridgeC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；以0.01mol/L醋酸钠溶液(pH4.75)-乙腈(98：2)为流动相；流速为1.0ml/min；柱温30℃；波长为254nm；进样量10μl。b、系统适用性溶液的配制称取头孢菌素C钠盐对照品约25mg两份，精密称定，分别置于两个100ml容量瓶中，用0.01mol/L醋酸钠溶液(pH4.75)溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。每份对照溶液进样2次，完成系统适用性实验。头孢菌素C峰(指吸收峰，下同)与相邻杂质峰间的分离度应大于1.5，理论塔板数不得低于2000，拖尾因子不得过2.5。c、根据上述色谱条件，取待测液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，用外标法进行计算，公式如下：样品中头孢菌素C残留效价(μg/g)＝对照品的响应因子×样品的峰面积×样品稀释倍数由上式可推导公式如下：上式中：X—样品中头孢菌素C残留效价，μg/g；m对—对照品的质量，mg；m样—样品质量，g；P—对照品中头孢菌C的百分含量，％；A对—对照品的峰面积；A样—样品的峰面积；D样—样品的稀释倍数；100—对照品的稀释倍数；1000—单位换算系数。4)三批喷雾干燥灭活头孢菌渣中头孢菌素C残留测定结果数据系统适用性试验及三批喷雾干燥灭活头孢菌渣中头孢菌素C残留的测定结果见图1、图2、图3以及表1。由系统适用性实验，即由对照溶液的液相色谱图可得出：对照品中头孢菌素C的保留时间为11.146min；头孢菌素C峰面积为2595.89575[mAU*s]，结合图1、图2和图3中头孢菌素C峰面积可计算得到头孢菌素C残留效价，具体见表1。表1实施例1中喷雾干燥灭活头孢菌渣中头孢菌素C残留测定结果实施例2液体灭活头孢菌渣中头孢菌素C残留效价测定1)缓冲液的配制同实施例1中的步骤1)。2)头孢菌渣提取分离取液体灭活头孢菌渣样，使用中等力度用研磨钵300圈以上，研磨至细腻均一的糊状，使其粒径为D97＝33.20μm；称取液体灭活头孢菌渣研磨样4g，于50ml聚丙烯离心管中，加入20ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.0)，涡旋振荡1min，超声辅助提取30min，以4500rpm离心10min，取上清液。3)头孢菌素C残留效价检测同实施例1中的步骤3)。4)三批液体灭活头孢菌渣中头孢菌素C残留测定结果数据系统适用性试验以及三批液体灭活头孢菌渣中头孢菌素C残留测定结果见表2。由系统适用性实验，即由对照溶液的液相色谱图可得出：对照品中头孢菌素C峰的保留时间为10.571min；头孢菌素C峰面积为2637.47290[mAU*s]，结合三批液体灭活头孢菌渣中头孢菌素C的峰面积(831.86438、887.60870、1305.93384)可计算得到头孢菌素C残留效价，具体见表2。表2实施例2中液体灭活头孢菌渣中头孢菌素C残留测定结果以下用实验例的方式说明本发明的有益效果。实验例1重复性实验称取头孢菌素C钠盐对照品约25mg两份，精密称定，分别置于两个100ml容量瓶中，用0.01mol/L醋酸钠溶液(pH4.75)溶解并稀释至刻度，称取喷雾灭活头孢菌渣研磨样2g，于50ml聚丙烯离心管中，加入20ml的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.0)，涡旋振荡1min，超声辅助提取30min，以4500rpm离心10min，取上清液。取对照溶液0.5ml、样品溶液1ml，混合定容至10ml，按分析方法的色谱条件重复测定5次，结果见表3。表3重复性实验序号头孢菌素C峰保留时间头孢菌素C峰面积111.976703.58228211.967701.60175311.963699.12354411.964698.61322511.964696.63739RSD0.05％0.4％结论：连续进样6次，保留时间的RSD为0.05％，峰面积的RSD为0.4％，表明重复性良好。实验例2检测限与定量限精密称取头孢菌素C钠盐对照品约25.41mg于100ml容量瓶中，用0.01mol/L醋酸钠溶液(pH4.75)溶解并稀释至刻度，摇匀，待用。精密量取0.1ml对照溶液到100ml容量瓶中，用0.01mol/L醋酸钠溶液(pH4.75)稀释至刻度得约0.25mg/L的溶液，再逐级稀释，进样，观察色谱图，以头孢菌素C信噪比为10:1时相应浓度确定定量限，以头孢菌素C信噪比为2～3：1时相应浓度确定检测限，结果见图4和表4。表4检测限和定量限测定结果项目浓度(μg/ml)信噪比定量限0.042511.1检测限0.00852.9结论：检测限为0.0085μg/ml，定量限为0.0425μg/ml，能够满足测定要求。实验例3回收率精密称取头孢菌素C钠盐对照品适量，用0.01mol/L醋酸钠溶液(pH4.75)溶解并稀释至刻度，配成浓度约为0.25mg/ml的溶液，作为对照品溶液。称取2.0000g(精确至0.1mg)用研钵研磨至细腻均一粉状的喷干灭活的固体头孢菌渣样于50ml聚丙烯离心管中，加入20ml0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.0)，涡旋振荡1min，超声提取30min，以4500rpm离心10min，取上清液做为供试品溶液。精确吸取1.0ml的供试品溶液，9份，每3份分别加入0.2ml、0.5ml、1.0ml的对照品溶液至10ml容量瓶中，加0.01mol/L醋酸钠溶液(pH4.75)定容，每份进样一次，结果见表4以及图5、图6，其中图5为头孢菌素C对照品图谱，图6为250mg/kg的加标浓度头孢菌素C回收率图谱。表5回收率测定结果结论：回收率在97.4％-110.2％之间，回收率9针的RSD值为6.2％，证实了该方法具有良好的回收率。综上，本发明利用高效液相色谱法测定头孢菌渣中头孢菌素C残留效价，本发明检测方法具有灵敏度高、分离效率高、选择性好、复性好、准确度高的优点，检测限可达0.0085μg/ml，定量限可达0.0425μg/ml。当前第1页1 2 3