本发明属于中药分析技术领域，尤其涉及一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法及应用。
背景技术
血瘀证包括血运不畅阻滞于静脉及脏腑，或离经之血积存于体内，或污秽之血所致的证候，可见于冠心病、脑血管病、肺心病、肝硬化等多种疾病。血瘀证患者多有血小板及凝血功能异常、血流动力学改变、外周循环障碍、炎症反应、结缔组织疾病中的至少一种情况。采用活血化瘀药物，特别是活血化瘀中药制剂是常用的治疗方法。
人体因为与外界的持续接触，包括呼吸(氧化反应)、外界污染、放射线照射等因素不断的在人体体内产生自由基。血瘀证患者对体内自由基清除不足，过量的自由基会引起细胞氧化性损伤、脂质过氧化等，可以损害所有类型的生物分子—脂质、蛋白质、碳水化合物和dna。从血瘀证角度来说，自由基中的羟自由基与脂质过氧化物是前列环素2(pgl2)合成酶活性的强烈选择性抑制剂，进而又可刺激血栓烷a2(txa2)的合成，导致血管收缩、血小板聚集，从而导致微循环障碍。自由基还可导致血流流变学异常，降低红细胞膜的流动性，并使血红蛋白形成海因茨小体(heinz小体)从而降低红细胞变形能力，使红细胞与血浆蛋白交联，提高血浆粘度，并降低红细胞滤过能力，还会破坏pgl2与txa2的平衡，导致血小板聚集、血栓形成，进一步影响血液流变特性。可见，自由基能够参与血瘀证的发生，因此很多药物发挥其活血化瘀功效的作用机理之一即是对抗自由基(即抗氧化)。《中国药典》2015年版收录的活血化瘀中药制剂有很多种，如血府逐瘀胶囊，其由桃仁(炒)、红花、赤芍、川芎、枳壳(麸炒)、柴胡、桔梗、当归、地黄、牛膝及甘草11味中药组成，具有活血祛瘀，行气止痛之功效，主要用于治疗瘀血停滞胸中而见胸痛、头痛，痛如针刺而有定处，或呃逆干呕、烦急、心悸失眠、午后潮热，或唇舌紫暗、舌有瘀点、脉弦涩等症。但《中国药典》2015年版收录了血府逐瘀胶囊粉末鉴别、薄层鉴别以及含量测定等项，并未收录抗氧化活性检测方法。由于抗氧化与活血化瘀有着重要联系，因此建立抗氧化活性检测方法对于提高活血化瘀中药制剂的质量控制标准具有重要意义。
技术实现要素：
针对现有技术中活血化瘀中药制剂的质量标准中没有抗氧化活性检测方法的问题，本发明提供一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法。
以及，本发明还提供按上述检测方法作为血府逐瘀胶囊抗氧化活性检测方法的应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下技术方案：
一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法，包括以下步骤：
步骤a、用25～75％v/v甲醇溶液超声提取所述活血化瘀中药制剂，得样品溶液，备用；
步骤b、取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，用纯甲醇溶解，得1,1-二苯基-2-三硝基苯肼甲醇工作溶液，备用；
步骤c、取所述样品溶液与所述1,1-二苯基-2-三硝基苯肼甲醇工作溶液混合，得待测溶液，其中所述1,1-二苯基-2-三硝基苯肼甲醇工作溶液中的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼与所述样品溶液中所述活血化瘀中药制剂的质量比为0.3：1～5；
步骤d、取所述样品溶液与25～75％v/v甲醇溶液混合，得空白溶液，其中所述样品溶液与所述甲醇溶液的体积比与步骤c中所述待测溶液中所述样品溶液与所述1,1-二苯基-2-三硝基苯肼甲醇工作溶液的体积比相等；
步骤e、取所述1,1-二苯基-2-三硝基苯肼甲醇工作溶液与25～75％v/v甲醇溶液混合，得对照溶液，其中所述甲醇溶液与所述1,1-二苯基-2-三硝基苯肼甲醇工作溶液的体积比与步骤c中所述待测溶液中所述样品溶液与所述1,1-二苯基-2-三硝基苯肼甲醇工作溶液的体积比相等；
步骤f、用酶标仪检测所述待测溶液、空白溶液、对照溶液的吸光度，检测波长为500～520nm；
步骤g、计算所述活血化瘀中药制剂的清除率，计算公式为
sr样品＝[1－(od药物－od空白)/od对照]×100％，其中sr样品为所述待测溶液的清除率，od药物为所述待测溶液的吸光度，od空白为所述空白溶液的吸光度，od对照为所述对照溶液的吸光度；
步骤h、以vc为内标物，用内标法对步骤d的测定结果进行校正，以sr样品/srvc表示所述活血化瘀中药制剂的抗氧化活性，其中srvc为vc的清除率。
本发明构建的活血化瘀中药制剂的抗氧化活性测定方法样品处理简单；采用酶标仪进行吸光度测定具有分析速度快、检测样品数量大、重现性好等优势；采用合理的待测制剂与dpph比例能够更准确得出ec50值；采用内标法能够排除仪器以及外界环境等因素的干扰，结果更加准确。本发明构建的方法可以弥补现有标准的不足，实现活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测，为活血化瘀中药制剂将抗氧化活性作为质量控制标准提供参考方法。
具体地，上述步骤a中所述超声提取中，提取每20mg所述活血化瘀中药制剂使用的所述甲醇＞1ml，以确保中药制剂中的抗氧化活性成分能够被充分提取出来，使测量结果更为准确。
进一步地，所述超声提取的时间为5～15min。超声时间太短则提取不完全，超声时间在5～15min内没有显著区别，时间太长则降低工作效率。
进一步地，超声提取还包括超声提取后离心，所述离心为14000rpm离心10min。经过离心后，使不溶物沉淀在离心容器底部，以便取上清液进行检测。
进一步地，所述样品溶液中所述活血化瘀中药制剂的含量为1～5mg/ml。样品溶液在该含量范围内与清除率sr具有良好的线性关系，测量结果可靠。
上述步骤f中所述检测波长为512nm。dpph甲醇溶液在512nm处的吸收最强，而经过与样品溶液或vc溶液反应后其吸收比较弱，有显著差异，可以使检测结果更为准确。
进一步地，所述用酶标仪检测所述待测溶液、空白溶液、对照溶液的吸光度的具体操作为：每45s读数一次，连续记录45min，取读数变化不超过5％的od值作为最终od值，用于计算所述抗氧化活性。通过连续读数可以判断反应终点，避免在反应未完成时进行检测造成检测结果偏低。
进一步地，所述用酶标仪检测时的温度为37℃，检测过程中多孔板为密封状态。所述温度接近人体温度，可以更真实地反应出待测的活血化瘀中药制剂在人体发挥抗氧化活性的作用。活血化瘀中药制剂或vc具有抗氧化活性，但也有可能被空气中的氧气氧化，从而影响实验结果的准确性，因此本发明优选在实验过程中密封多孔板来避免空气中的氧气对实验结果的干扰。
所述用酶标仪检测时的摇动频率为50hz。dpph与活血化瘀中药制剂或vc在该频率的摇动条件下进行反应，可以促进溶液混合均匀，进而使反应更加快速而完全，提高试验效率以及准确性。
以及，本发明还提供按上述检测方法作为血府逐瘀胶囊抗氧化活性检测方法的应用。
用本发明所提供的检测方法可以快速而准确的测得血府逐瘀胶囊的抗氧化活性，为血府逐瘀胶囊提高质量控制标准提供参考方法。
附图说明
图1为实施例7中血府逐瘀胶囊dpph清除活性研究标准曲线；
图2为实施例8中血府逐瘀胶囊dpph清除活性的量效曲线；
图3为实施例9中血府逐瘀胶囊dpph清除活性的主成分分析结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中的仪器与试药为：多功能酶标仪：
实施例1
本实施例提供了一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法。
取血府逐瘀胶囊内容物粉末0.5g，精密称定，置于25ml容量瓶中，用50％v/v甲醇定容至刻度，超声处理10min，摇匀，14000rpm离心10min，取上清液，再用50％v/v甲醇稀释成2.00mg/ml作为样品溶液，备用。
取dpph试剂25.00mg，精密称定，置于250ml棕色容量瓶中，用纯甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得dpph甲醇工作溶液。
取50μl样品溶液加至96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为待测溶液。
取50μl样品溶液加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μl50％v/v甲醇，作为空白溶液。
取50μl50％v/v甲醇加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为对照溶液。
将上述加入各溶液的96孔细胞培养板盖好密封盖，置于多功能酶标仪中，在500nm(37℃)处检测其动力学过程，每45s读数一次，连续记录45min，取读数变化不超过5％的od值作为最终od值，用于计算清除率。所有试验平行操作3次，取平均值，结果见表1。
实施例2
本实施例提供了一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法。
取血府逐瘀胶囊内容物粉末0.5g，精密称定，置于25ml容量瓶中，用75％v/v甲醇定容至刻度，超声处理10min，摇匀，14000rpm离心10min，取上清液，再用75％v/v甲醇稀释成2.00mg/ml作为样品溶液，备用。
取dpph试剂25.00mg，精密称定，置于250ml棕色容量瓶中，用纯甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得dpph甲醇工作溶液。
取50μl样品溶液加至96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为待测溶液。
取50μl样品溶液加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μl75％v/v甲醇，作为空白溶液。
取50μl75％v/v甲醇加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为对照溶液。
将上述加入各溶液的96孔细胞培养板盖好密封盖，置于多功能酶标仪中，在512nm(37℃)处检测其动力学过程，每45s读数一次，连续记录45min，取读数变化不超过5％的od值作为最终od值，用于计算清除率。所有试验平行操作3次，取平均值，结果见表1。
实施例3
本实施例提供了一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法。
取血府逐瘀胶囊内容物粉末0.5g，精密称定，置于25ml容量瓶中，用25％v/v甲醇定容至刻度，超声处理10min，摇匀，14000rpm离心10min，取上清液，再用25％v/v甲醇稀释成2.00mg/ml作为样品溶液，备用。
取dpph试剂25.00mg，精密称定，置于250ml棕色容量瓶中，用纯甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得dpph甲醇工作溶液。
取50μl样品溶液加至96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为待测溶液。
取50μl样品溶液加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μl25％v/v甲醇，作为空白溶液。
取50μl25％v/v甲醇加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为对照溶液。
将上述加入各溶液的96孔细胞培养板盖好密封盖，置于多功能酶标仪中，在520nm(37℃)处检测其动力学过程，每45s读数一次，连续记录45min，取读数变化不超过5％的od值作为最终od值，用于计算清除率。所有试验平行操作3次，取平均值，结果见表1。
实施例4
本实施例提供了一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法。
取血府逐瘀胶囊内容物粉末0.5g，精密称定，置于50ml容量瓶中，用50％v/v甲醇定容至刻度，超声处理10min，摇匀，14000rpm离心10min，取上清液，再用50％v/v甲醇稀释成2.00mg/ml作为样品溶液，备用。
取dpph试剂25.00mg，精密称定，置于250ml棕色容量瓶中，用纯甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得dpph甲醇工作溶液。
取50μl样品溶液加至96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为待测溶液。
取50μl样品溶液加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μl50％v/v甲醇，作为空白溶液。
取50μl50％v/v甲醇加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为对照溶液。
将上述加入各溶液的96孔细胞培养板盖好密封盖，置于多功能酶标仪中，在512nm(37℃)处检测其动力学过程，每45s读数一次，连续记录45min，取读数变化不超过5％的od值作为最终od值，用于计算清除率。所有试验平行操作3次，取平均值，结果见表1。
实施例5
本实施例提供了一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法。
取血府逐瘀胶囊内容物粉末0.5g，精密称定，置于25ml容量瓶中，用50％v/v甲醇定容至刻度，超声处理5min，摇匀，14000rpm离心10min，取上清液，再用50％v/v甲醇稀释成2.00mg/ml作为样品溶液，备用。
取dpph试剂25.00mg，精密称定，置于250ml棕色容量瓶中，用纯甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得dpph甲醇工作溶液。
取50μl样品溶液加至96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为待测溶液。
取50μl样品溶液加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μl50％v/v甲醇，作为空白溶液。
取50μl50％v/v甲醇加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为对照溶液。
将上述加入各溶液的96孔细胞培养板盖好密封盖，置于多功能酶标仪中，在512nm(37℃)处检测其动力学过程，每45s读数一次，连续记录45min，取读数变化不超过5％的od值作为最终od值，用于计算清除率。所有试验平行操作3次，取平均值，结果见表1。
实施例6
本实施例提供了一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法。
取血府逐瘀胶囊内容物粉末0.5g，精密称定，置于25ml容量瓶中，用50％v/v甲醇定容至刻度，超声处理15min，摇匀，14000rpm离心10min，取上清液，再用50％v/v甲醇稀释成2.00mg/ml作为样品溶液，备用。
取dpph试剂25.00mg，精密称定，置于250ml棕色容量瓶中，用纯甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得dpph甲醇工作溶液。
取50μl样品溶液加至96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为待测溶液。
取50μl样品溶液加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μl50％v/v甲醇，作为空白溶液。
取50μl50％v/v甲醇加至上述96孔细胞培养板的平行3个复孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，作为对照溶液。
将上述加入各溶液的96孔细胞培养板盖好密封盖，置于多功能酶标仪中，在512nm(37℃)处检测其动力学过程，每45s读数一次，连续记录45min，取读数变化不超过5％的od值作为最终od值，用于计算清除率。所有试验平行操作3次，取平均值，结果见表1。
表1
实施例7
本实施例提供了一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法的方法学考察。
1.线性关系考察
取血府逐瘀胶囊内容物粉末0.5g，精密称定，置于25ml容量瓶中，用50％v/v甲醇定容至刻度，超声处理10min，摇匀，14000rpm离心10min，取上清液，再用50％v/v甲醇稀释成浓度为5.00mg/ml、4.00mg/ml、3.33mg/ml、2.5mg/ml、2.00mg/ml、1.00mg/ml的样品溶液。
按上述实施例1中dpph甲醇工作溶液、待测溶液、空白溶液、对照溶液的配制方法配制各溶液，按上述实施例1的操作方法测定各溶液的od值，所有试验平行操作3次，取平均值。结果显示血府逐瘀胶囊在0.25mg/ml～1.25mg/ml(终浓度)范围内与清除率sr具有良好线性关系，其线性方程为y＝63.04x+14.06(r2＝0.9973)。结果见图1。
2.日内精密度考察
取血府逐瘀胶囊内容物粉末0.5g，精密称定，置于25ml容量瓶中，用50％v/v甲醇定容至刻度，超声处理10min，摇匀，14000rpm离心10min，取上清液，再用50％v/v甲醇稀释成浓度为3.33mg/ml、2.5mg/ml、2.00mg/ml、1.25mg/ml的样品溶液。
按上述实施例1中dpph甲醇工作溶液、待测溶液、空白溶液、对照溶液的配制方法配制各溶液。
精密称取vc10mg，置于100ml容量瓶中，加50％v/v甲醇定容至刻度，摇匀，得vc储备液，用50％v/v甲醇将储备液稀释至浓度为0.03mg/ml，得到vc工作溶液。以vc工作溶液作为内标，将其50μl加至96孔细胞培养板孔中，并加入150μldpph甲醇工作溶液，平行3个复孔，作为内标待测溶液；将50μlvc工作溶液及150μl50％v/v甲醇溶液混合，作为内标空白溶液；将50μl50％v/v甲醇及150μldpph甲醇溶液混合，作为内标对照溶液。
每个浓度在同一块培养板上做6组重复，每组平行3个复孔，按上述实施例1的操作方法测定上述各溶液的od值，结果见表2～4。
3.日间精密度考察
按日内精密度项下连续做3天，考察血府逐瘀胶囊dpph清除活性研究的日间精密度。
日内精密度和日间精密度的考察结果见表2～4：样品浓度为3.33mg/ml的结果见表2，样品浓度为2.50mg/ml的结果见表3，样品浓度为2.00mg/ml的结果见表4。
表2
表3
表4
由表2～4的结果可见，本方法的日内精密度和日间精密度均良好。
4.稳定性试验考察
按日内精密度考察试验配制各溶液，置于4℃冰箱中，分别在0h、2h、4h、8h、10h、12h时测定各溶液od值，结果见表5。
表5
由表5结果可见，本方法的12h稳定性良好。
5.重复性试验考察
按日内精密度考察试验配制浓度为3.33mg/ml、2.00mg/ml、1.25mg/ml的样品溶液，每份样品溶液取3份配制待测溶液。按日内精密度考察试验配制其他各溶液，按上述实施例1的操作方法测定上述各溶液的od值，结果见表6。
表6
由表6结果可见，本方法的重复性良好
实施例8
本实施例提供了一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法的量效曲线。
取血府逐瘀胶囊内容物粉末0.5g，精密称定，置于25ml容量瓶中，用50％v/v甲醇定容至刻度，超声处理10min，摇匀，14000rpm离心10min，取上清液，再用50％v/v甲醇稀释成浓度为20.00mg/ml、10.00mg/ml、5.00mg/ml、3.33mg/ml、2.00mg/ml、1.00mg/ml、0.40mg/ml、0.20mg/ml、0.10mg/ml、0.04mg/ml的样品溶液。
按上述实施例1中dpph甲醇工作溶液、待测溶液、空白溶液、对照溶液的配制方法配制各溶液。
按上述实施例1的操作方法测定上述各溶液的od值，结果见表7、图2。
表7
由实验结果可见，血府逐瘀胶囊有明显的dpph清除活性，即抗氧化活性，且存在剂量依赖关系，由图2量效曲线计算得其ec50值为0.52mg/ml。
实施例9
本实施例提供了42批血府逐瘀胶囊抗氧化活性的测定。
按实施例1配制42批血府逐瘀胶囊的样品溶液及其他各溶液，按上述实施例7的操作方法测定上述各溶液的od值，并以血府逐瘀胶囊的抗氧化活性数据为变量，采用simca-p14.0进行主成分分析，结果见表8、图3。
表8
由表8、图3结果可见，血府逐瘀胶囊具有良好的清除自由基能力及抗氧化活性，且42批血府逐瘀胶囊抗氧化活性较稳定，无明显差异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。