检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光试剂盒及方法与流程

本发明提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞e-cadherin表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位；在部分地区的农村中居第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％，肝癌平均患病年龄44岁。肝癌病理分型为肝细胞癌、胆管细胞癌、混合型肝癌，其中肝细胞癌占70-80%，其恶性程度高，发展迅速，若治疗不及时或治疗方案选择不当，平均生存时间为半年左右。肝细胞癌早期无症状，一旦出现明显症状，约有1/3已属晚期，患者会感到肝区胀痛，尤其饭后为甚，厌食，肝大，右上腹肿块，不明原因的消瘦、腹胀、腹泻、间断性发热、乏力、食欲减退等，严重影响人类寿命及生活质量。

随着分子生物学的发展，中晚期肝细胞癌的免疫治疗逐渐兴起，初步的临床试验也取得了较好的疗效，目前多项iii期临床试验正在开展，e-钙粘蛋白(e—cadherin)是上皮细胞表型最经典的标志物，e-cadherin表达的下调标志着细胞之间粘附能力的下降，因此e-cadherin被当做鉴定肝细胞癌e-cadherin发生的主要手段之一，作为一类细胞表面糖蛋白，e-cadherein在细胞-细胞之间的粘附中发挥重要作用，并参与组织器官的维持。近年来有关于肝细胞癌e-cadherin和肿瘤耐药之间的关系日益受到重视，大量研究显示在不同的肿瘤当中由于e-cadherein的发生而同时耐药性的升高，并且都伴随着e-cadherin表达的改变。目前，国内外肝细胞肝细胞癌诊治指南均认为：肝细胞癌e-cadherin突变检测的时间点包括初诊时及争取在疾病进展时再次检测，应通过重复检测减少假阳性和假阴性。

循环肿瘤细胞（circulatingtumorcell，ctc）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因ctc检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。

免疫荧光分析技术即将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来用以研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而对抗原进行细胞定性和定位分析。

针对目前临床实践中，肝细胞癌患者e-cadherin检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(ctc)e-cadherin表达情况对肝细胞癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。

目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东凯歌智能机器有限公司就循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术、检测设备、试剂盒开发与生产进行合作，山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位进行推广应用，本项目为山东省重大科技创新工程项目，以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括pd1、pd-l1、er、pr、her-2、gpc-3、vegf、p53、vimentin、tki-egfr、ras、ck、alk-d5f3、cd20、alk/eml4、beta-catenin、e-cadherin、ep-cam、hpv、idh-1、psa、psma、vegf、gfap、细胞角蛋白、ae1/ae3、雌激素受体、孕激素受体、bca-225、ca125、cea、ema、ercc1、hpv、ki-67、p53、top2a等作为ctcs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东凯歌智能机器有限公司、山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行研发与推广。

技术实现要素：

针对现有技术中的检测肿瘤晚期或复发肝细胞癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者e-cadherin实时动态状态及现有检测方法容易出现假阳性和假阴性的缺点，本发明提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞e-cadherin表达的免疫荧光试剂盒及检测方法：利用膜过滤装置分离获得晚期肝细胞癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（ctc），进一步运用免疫荧光技术检测ctc中e-cadherin表达情况。

本发明通过以下技术方案实现：

一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞e-cadherin表达的免疫荧光试剂盒，包括375μl8%pfa，200μl0.4%pfa，200μl0.3%tritonx-100，100μl10%山羊血清，兔抗人e-cadherin、大鼠抗cd45组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗兔、荧光标记的羊抗大鼠组成的二抗混悬液100μl，dapi封片剂；

所述的一抗混悬液中兔抗人e-cadherin、大鼠抗cd45分别用pbs缓冲液按1:100和1:200稀释，混合后总体积为100μl；

所述的二抗混悬液中荧光标记的羊抗兔和荧光标记的羊抗大鼠分别用pbs缓冲液按1:100稀释，混合后总体积为100μl。

一种利用本发明中所述的试剂盒非诊断目的检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞e-cadherin表达的免疫荧光方法，包括以下步骤：

（1）外周血采集：用2ml抗凝管采集无法获取组织标本的晚期或复发肝细胞癌患者肘正中静脉外周血1ml，后采集的5ml作为待检测的外周血样；为确保样本质量，如受试者无其他采血项目，先用2ml抗凝管采集1ml静脉血，该管弃用不作为正式样本；再用bdedta抗凝管采集测试样本，样本量保证至少5ml。如受试者有其他采血项目，在其他采血项目完成后采集本测试所需样本，这样可省去采集首管血的步骤；样本保存无需冷藏，室温即可，采集后需要在2小时内进行前处理。如不能在2小时内移交检测，请置于4℃冰箱保存，但应避免隔夜，放置于4℃冰箱保存的样本，处理前至少在室温环境下复温30分钟以上；

（2）外周血样预处理：将采集的外周血样5ml加入15ml离心管中，补加生理盐水至15ml，再加入375μl8%pfa，并轻轻颠倒混匀，室温预固定10min；

（3）样本分离：利用膜过滤装置对外周血进行肿瘤细胞分离，获得外周血循环肿瘤细胞；

（4）甲醇固定：向膜过滤装置中的滤器中加入500μl甲醇，室温固定1min，去掉多余的甲醇；

（5）贴膜：将膜过滤装置中的滤膜取出，在在载玻片左上角滴加5μl甲醇,将滤膜正面朝上贴于玻片，自然晾干10min，滴加10μl的去离子水于玻片上，将晾干的滤膜用镊子揭下后再贴平在滴加有去离子水的玻片处，50℃下处理10min，去除滤膜背面细胞；如果因时间等关系不能马上进行免疫荧光染色，至少应处理至该步，即将滤膜取出贴到载玻片上后，置于4°c进行保存。如果要长期存放，置于-20°c进行保存；

（6）组化笔画圈：用组化笔在滤膜周围画一个比滤膜稍大的封闭的圆圈，待2min晾干；

（7）细胞固定：向滤膜上滴加200μl0.4%pfa，室温固定5min，完成后pbs漂洗3次，每次3min；

（8）细胞穿透：向滤膜上滴加200μl0.3%tritonx-100室温放置3min，完成后pbs漂洗3次，每次3min；

（9）封闭：向滤膜上滴加100μl10%山羊血清，室温封闭30min；

（10）一抗孵育：滤膜上滴加50-100μl一抗混悬液，4℃过夜孵育，第二天放入37℃复温15min，孵育完成后pbs漂洗3次，每次3min；

（11）二抗孵育及核染色：滤膜上滴加100μl二抗混悬液，37℃孵育45min，孵育完成后pbs漂洗3次，每次4min；

（12）封片及检测：滴加dapi封片剂封片，于荧光显微镜下镜检。

优选地，所述的膜过滤装置为循环肿瘤细胞分离仪，滤膜为ctcbiopsy滤膜。

优选地，步骤（3）所述的样本分离由仪器半自动完成，步骤如下：

（1）将滤器放于循环肿瘤细胞分离仪支撑模块的正中间，确保下胶塞被下针刺穿；

（2）向滤器中加入8ml固定好的外周血样，待样本分离完毕后，再加入剩余7ml外周血样，完成样本分离；

（3）加入2mlpbs，进行样本漂洗，漂洗两次。

优选地，所述的孵育过程在不透光的湿盒中完成。

有益效果

（1）本发明提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发肝细胞癌患者e-cadherin表达情况，利用微创技术，能够实现实时动态检测；

（2）本发明提供的方法，循环肿瘤细胞分离好，能够避免血细胞的干扰，能够避免染色过程中可能产生的边缘效应导致的假阳性结果，稳定性好，降低细胞的损失，提高检测的准确性。

附图说明

图1为晚期肝细胞肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞免疫荧光染色图像。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明阐述如下。

本发明实施例所使用的免疫荧光试剂盒具体规格如表1所示：

表1

所述的一抗混悬液由兔抗人e-cadherin和大鼠抗cd45组成，取等量的兔抗人e-cadherin和大鼠抗cd45，分别用pbs缓冲液按1:100和1:200稀释，混合后总体积为100μl；

所述的二抗混悬液由荧光标记的羊抗兔和荧光标记的羊抗大鼠组成，分别为市售alexafluor488goatanti-rabbit和alexafluor546goatanti-rat，取等量的上述两种种荧光标记二抗，分别用pbs缓冲液分别按1:200稀释并混匀得二抗混悬液，混合后总体积为100μl。

本发明实施例中使用的循环肿瘤细胞分离仪的型号为yzymed-a10，用于血样过滤分离，滤膜为ctcbiopsy滤膜。

运用此技术方法分离获取并鉴定8例肝细胞癌患者（同时检测8例正常人样本做阴性对照）外周血循环肿瘤细胞的实施例。

实施例1

一、循环肿瘤细胞分离仪（yzymed-a10）滤器的润洗

a)打开滤器上下塞并将滤器放置在润洗支架上；

b)用巴氏管向滤器内加入约2ml的75%医用酒精待其从滤器下口自然滤出。

c)向滤器内加入8ml生理盐水进行漂洗，去除滤器内残留酒精，自然滤出生理盐水；

d)重复2次步骤3，留适量生理盐水以保证滤膜湿润即可，装上滤器下塞。

注意：如果在滤器润洗过程中存在酒精无法自然滤出或滤出过慢的情况，请立即弃用该滤器。

二、运用免疫荧光检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞e-cadherin表达的方法：

（1）外周血采集：用2ml抗凝管采集无法获取组织标本的晚期或复发肝细胞癌癌患者肘正中静脉外周血1ml，该管弃用不作为正式样本；再用bdedta抗凝管采集测试样本，样本量为5ml，作为待检测的外周血样；

（2）外周血样预处理：将采集的外周血样5ml加入15ml离心管中，补加生理盐水至15ml，再加入375μl8%pfa，并轻轻颠倒混匀，室温预固定10min；

（3）样本分离：利用膜过滤装置对外周血进行肿瘤细胞分离，获得外周血循环肿瘤细胞，具体得操作为为循环肿瘤细胞分离仪：

a）将滤器放于循环肿瘤细胞分离仪支撑模块的正中间，确保下胶塞被下针刺穿；

b）向滤器中加入8ml固定好的外周血样，待样本分离完毕后，再加入剩余7ml外周血样，完成样本分离；

c）加入2mlpbs，进行样本漂洗，漂洗两次；

（4）甲醇固定：向膜过滤装置中的滤器中加入500μl甲醇，室温固定1min，点击“开始”按钮运行机器排尽甲醇，如有甲醇残留，将滤器从机器上取下，打开下胶塞，盖上上胶塞，使得残余的甲醇自然流出；

（5）贴膜：将膜过滤装置中的滤膜取出，在载玻片左上角滴加5μl甲醇,将滤膜正面朝上贴于玻片，自然晾干10min，滴加10μl的去离子水于玻片上，将晾干的滤膜用镊子揭下后再贴平在滴加有去离子水的玻片处，50℃下处理10min，去除滤膜背面细胞；

（6）组化笔画圈：用组化笔在滤膜周围画一个比滤膜稍大的封闭的圆圈，待2min晾干；

（7）细胞固定：向滤膜上滴加200μl0.4%pfa，室温固定5min，完成后pbs漂洗3次，每次3min；

（8）细胞穿透：向滤膜上滴加200μl0.3%tritonx-100室温放置3min，完成后pbs漂洗3次，每次3min；

（9）封闭：向滤膜上滴加100μl10%山羊血清，室温封闭30min；

（10）一抗孵育：滤膜上滴加50-100μl一抗混悬液，4℃过夜孵育，第二天放入37℃复温15min，孵育完成后pbs漂洗3次，每次3min；

（11）二抗孵育及核染色：滤膜上滴加100μl二抗混悬液，37℃孵育45min，孵育完成后pbs漂洗3次，每次4min

（12）封片及检测：滴加dapi封片剂封片，于荧光显微镜下镜检；图1为晚期肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞免疫荧光染色图像，根据免疫学及形态学表现，发现肿瘤细胞细胞体积大，核质比异常，免疫学表现为典型的ctcs。

本发明通过膜分离方法分离外周血循环肿瘤细胞（ctcs），根据肿瘤细胞与正常细胞得形态学差异及免疫学特征鉴定ctcs，利用该方法指导肝细胞癌的靶向治疗，为肝细胞癌靶向治疗提供新的思路。