专利名称：异硫代伏杀磷的免疫测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用免疫测定法检测低浓度的异硫代伏杀磷类化合物。
异硫代伏杀磷类化合物在许多存在水和湿气的应用场合广泛地用作生物杀伤剂。在这些应用的许多场合需要测定该系统中异硫代伏杀磷的正确的剂量的稳定性。该技术领域目前的情况是使用高压液相色谱分析法，但这种方法费时、繁琐并且价格昂贵。
1988年3月23日公开的西屋电气公司(WestinghouseElectricCoyporation)的欧洲专利申请(申请号为0260829发明人是KEennethW.Hanter)公开了可同氯化酚类(尤其是五氯苯酚)反应的单克隆抗体以及产生这些抗体的杂交瘤。还公开了用于检测这些氯化酚类的免疫测定法。虽然许多化合物的检测方法大大地得益于免疫测定法，但是合适的细胞系却很难产生。
美国专利4865972(Hunter)公开了一种以抗体为基础的测定酶诱导化合物[例如二苯并二喔星(dibenlodioxinc)]的方法。异硫代伏杀磷不是酶诱导化合物。
Kohler和MILSTEIN在Nature265;495(1975)中最先描述了针对绵羊红细胞的单克隆抗体是如何通过用肿瘤细胞融合可产生B-淋巴细胞的特定抗体以导致“永生的”自制杂交克隆(或杂交瘤)形成，这种杂交克隆可以在细胞培养物中(试管中)或动物身上(在体内)合成单个的单克隆抗体。
本发明的目的是提出一种经过改进的检测异硫代伏杀磷化合物的方法。
本发明的另一目的是培育一种用于检测异硫代伏杀磷的免疫测定法的细胞系。
这些目的以及从以下公开内容显示出的其他的目的是通过本发明实现的。本发明一方面包括一个新的细胞系，该细胞系能产生可与3-异硫代伏杀磷(尤其是5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷)反应的单克隆抗体。本发明还涉及到可和这些异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体和多克隆抗体。本发明涉及抗体、制备这些抗体的方法、分析、论断、监测、分离，以及使用这些抗体的其它方法，以及含有用作这种用途的这些抗体的组合物。此外，本发明还涉及可产生单克隆抗体的杂化物以及制备这些杂交瘤的方法。最后，本发明还涉及异硫代伏杀磷和大分子载体的免疫原结合物以及制备这些结合物的方法。
图1表示根据本发明的免疫测定法的异硫代伏杀磷的四个不同种类的结合的抑制百分比。
异硫代伏杀磷作为一个类别是具有1.053×103mol/秒的与硫醇反应的一级速度常数的强反应亲电试剂(见P.J.cllie等人在J.Appl Bacteriol;69;578-584，1991的文章)。5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷还具有在同硫醇类发生开环反应后进一步反应的能力。已知血清和红细胞中含有大量的谷光甘肽(一种被还原的硫醇化合物)。紧接在异硫代伏杀磷被加到牛血清之后无论是用生物测定法、紫外分光光度法或高效液色谱法(Proclin
300 product bulletin，Rehm and Haas Company，Philadelphia，PA)都不能检测出异硫代伏杀磷，这意味着异硫代伏杀磷和亲核试剂发生反应并且破坏了完整的环结构。这种用实验说明过的异硫代伏杀磷同血清中已知存在的亲核试剂的快速反应引导人们推测;为了诱导抗体的形成而被注入动物体内的完整的异硫代伏杀磷并不能存活足够长的时间以便和免疫系统的适当组分发生相互作用。因此，完全不能指望可诱导出针对异硫代伏杀磷的抗体。
我们业已发现了一些可以满足许多现有分析技术所不能满足的苛刻要求的新颖的抗体。这样的抗体使得我们可以用各种快速的、简单的、价格合理的免疫测定技术检测生物杀伤剂。这些新颖的抗体用于分析水中的异硫代伏杀磷化合物尤为有效，因为所述异硫代伏杀磷不必被萃取出来。
可以使用多克隆抗体，但使用单克隆抗体更为可取。单克隆抗体是从使得它们具有非常强的特异性和均匀性的B-淋巴细胞无性繁育系(“杂交瘤”)中衍生出来的。这样的杂交瘤实际上是一种自身复制的“工厂”，能潜在地无限地供给单个的、被预先限定了特异性的抗体。
虽然本发明的单克隆抗体的产生是针对5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷(“651”)，但它也可以和其他异硫代伏杀磷类(例如2-甲基-3-异硫代伏杀磷(“573”)、4，5-二氯-2-n-辛基-3-异硫代伏杀磷(“287”)和2-n-辛基-3-异硫代伏杀磷(“893”)发生交叉反应，如图1所示那样。
用于本发明的异硫代伏杀磷具有如下分子式;
其中R1和R2各自选自氢、卤素或(C1-C4)烷基，或者可以相互连接形成饱和的、不饱和的或芳香的5节或6节稠合碳环;Y是氢、未被取代的或被卤素取代的(C1-C18)烷基，未被取代的或被卤素取代的2至8个碳的链烯基或炔基，未被取代的或被卤素取代的(C3-C8)环烷基，芳烷基或被卤素取代的、被(C1-C4)烷基取代的或被(C1-C4)烷氧基取代的最多可达10个碳原子的芳烷基或芳香基或被卤素取代的、被(C1-C4)烷基取代的，或被(C1-C4)烷氧基取代的最多可达10个碳原子的芳香基。
典型的Y取代基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、己基、辛基、环己基、4-甲氧苯基、4-氯苯基、3，4-二氯苯基、苯基、4-甲基苄基、4-氯苄基、苯乙基、4-苯基丁基、氯甲基、氯丙基、氢以及类似基。
制备单克隆抗体可采用以下方式产生一种异硫代伏杀磷和大分子载体的免疫原结合物，用这种结合物使动物免疫，以便从该动物体内得到抗体生成细胞，用肿瘤细胞融合这些细胞以生成杂交瘤，从这些杂交瘤中选择出至少一种可产生与异硫代伏杀磷反应的抗体的杂交瘤并且从所选择的杂化物中回收生成的抗体。
在体内产生可和异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体的方法涉及到将一个可产生这些抗体的杂交瘤通过腹膜注入组织相容的或受到免疫抑制的宿主中并从该宿主的腹水中回收生成的抗体。一个可产生针对异硫代杀磷的单克隆抗体的传代细胞系按以下方式制备产生一种异硫代杀磷的免疫原结合物，用该结合物使动物免疫，以便从该动物体内取得抗体生成细胞，用肿瘤细胞融合抗体生成细胞以产生杂交瘤，从中选择出一种可产生能与异硫代伏杀磷反应的抗体的杂化物并且以无性繁殖方式将所选择的杂交瘤扩大成一个细胞系。所研制出的用于651的传代细胞系被称作“抗-651”抗体。
为了检测样品中是否存在硫代伏杀磷或检测其浓度，将可与异硫代杀磷反应的单克隆抗体加到样品中并通过免疫测定法检测是否存在异硫代伏杀磷或检测其浓度，在该方法中，单克隆抗体用作试剂。
在可接受的载体内最好加有单克隆抗体。
抗-651抗体可用标准操作方法耦联到酶辣根过氧化酶(“HRP”)。这个被耦联的酶-抗体可以用作测定诸如木材、皮革和塑料这些固体基质中所存在的异硫代伏杀磷的着色剂。将准备检测的基质用适当的方法切成薄片，然后和被耦联的酶-抗体一起保温一段时间，在此期间同异硫代伏杀磷或异硫代伏杀磷类反应。保温后，将未结合的酶-抗体用缓冲液(例如PBS-Tween)洗涤除去。接下去被处理的基质材料和酶底物一起保温，市售的许多生色化合物都可以用作酶底物。基质用一定容量的底物加以处理，底物容量的多少以使有色产物不从反应位置上扩散光为准。另一方面，底物可被加到覆盖在被处理过的底物上的膜上。这样一种产品的例子是出自国际生化公司(“IBZ”)的EnzygraphicWeb。通过对所述基质或被底物渗透的膜的目测或显微镜观测，将所述异硫代伏杀磷限制在一定区域。
使用酶耦联抗体的替代方式是使用铁蛋白或金标记抗体或使用放射性标记抗体，放射性标记抗体需要将被处理过的基质暴露给照相胶片。
抗体也可以被用来测定诸如木材、塑料或皮革这些固体基质中是否存在异硫代伏杀磷并检测出其浓度。为了检测固体基质中是否存在异硫代伏杀磷，可将该基质的薄片在蛋白质阻断试剂[例如脱脂牛奶或牛血清清蛋白(“BSA”)]的溶液中浸泡30-60分钟。然后，该薄片用PBS-Tween(PBS-T)缓冲液迅速漂洗并在抗-651抗体(该抗体与辣根过氧化酶共价耦合)中暴露15分钟。然后，将薄片用PBS-T缓冲液冲洗两次，每次洗一段时间。而后，通过将薄片放入含有HRP[例如ABTS(2，2’-连氮基-双-3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸]的底物的试管中可以对耦合的抗-651-HRP复合物进行目测。换句话讲，酶底物可以以附着在固体支撑物[例如可以从市场上买到的EnzygraphicWeb(IBI)]上的溶液或底物的形式置于木材表面上。颜色的显现表明异硫代伏杀磷的存在，颜色的深度与异硫代伏杀磷的浓度有关。
免疫方法以所选择的免疫反应为基础用来将异硫代伏杀磷从基质中分离或除去，在该反应中与异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体被用作抗体。
用于将异硫代伏杀磷从含有该化合物的基质中分离或除去的组合物包括有效剂量的与异硫代伏杀磷化合物反应的单克隆抗体，它被固定在一种基质上或一种含有载体的混合物中。
制备与异硫代伏杀磷化合物反应的多克隆抗体采用如下方式产生一种硫代伏杀磷的免疫原结合物，用此结合物使动物免疫，从该动物体内抽取血液，从所述血液中分离出血清并从血清中回收抗体。
包括有以共价方式结合到大分子载体上的异硫代伏杀磷的免疫原结合物按如下方式制备将一个化合物以共价键方式连接到该大分子载体上并以共价键方式将异硫代伏杀磷的一种衍生物(例如含有一个反应基的衍生物)连接到该化合物上，于是形成了所述的免疫原结合物。
在一个特别优选的实施例中，本发明的单克隆抗体具有由杂化物细胞系ATCCSD1425或其他变种产生的单克隆抗体的特征。ATCCSD1425是生物学意义上的纯培养物，可从美国培养物保存中心[theAmericanFypeCultureCollection(ATCC)，1231ParklawnDrive，Rockville，MarylandUSA20852]获得，该培养物是1991年5月14日被保藏的。ATCCSD1425是通过将小鼠B-淋巴细胞和小鼠浆细胞融合来制备的。这些杂化物所产生的免疫球蛋白(抗体)属于IgG类。ATCCSD1425抗体的单克隆性是通过重复无性繁殖产生所述抗体的杂交瘤而得到保障的。
由ATCCSD1425产生的单克隆抗体阻止其他的单克隆抗体(这种抗体已经由其他的杂交瘤产生)与5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷发生反应，否则其他那些单克隆抗体也将发生同样的反应。
杂交瘤和传代细胞系可按如下方式制备(a)产生一种大分子载体与单克隆抗体所要追寻的那种特异的异硫代伏杀磷的免疫原结合物;
(b)用所述结合物使一动物免疫;
(c)从该动物体内取得抗体生成细胞;
(d)用肿瘤细胞融合抗体生成细胞以产生杂交瘤;
(e)从该杂交瘤之中筛选出一个可产生与上述步骤(a)制备的免疫原结合物反应的抗体的杂交瘤，以便产生一细胞系;
(f)从该杂化物之中筛选出一个可产生与任意的异硫代伏杀磷反应的抗体的杂交瘤，以及(g)无性繁殖。
单克隆抗体可在通过无性繁殖将其扩大成传代细胞系之前或之后从所选择的杂交瘤或杂交瘤群中加以回收。
另一方面，除脾细胞之外的细胞都可以用来制备针对异硫代伏杀磷的单克隆抗体。用本实施例制备的杂化物来制备本发明的单克隆抗体可采用下方式将其在适当的介质中培养并从该介质中回收这些抗体。
分子量接近或低于1000的物质(例如5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷，分子量152)不能正常地诱导抗体的生成，即它们是非免疫原。然而，这些物质通常能以化学方式结合到更大的免疫原载体(例如糖类或蛋白质)的分子上，以便诱导生成针对较小物质的抗体。制备半抗原和大分子载体(已知是半抗原)的免疫结合物的一般技术在本技术领域内是公知的。例如见1984年6月26日授予Sark的美国专利4456691以及Albro等人发表在[FoxicolAppl.Pharmacol，50，137-146(1979)]上的文章。
Albro等人和Stark的方法涉及通过化学桥或链将半抗原以共价键方式结合到大分子载体上。化学链指的是在相反的两个末端带有反应基的双官能团分子。反应基使化学链与大分子和半抗原上的反应基反应使化学链的一端以共价键方式结合到半抗原上。先将化学键结合到半抗原上，然后通过化学链另一端的反应基将所生成的化合物结合到大分子载体上。
已知针对结合到载体蛋白上的小的化合物生成的抗体不仅有助于识别化合物的结构，而且有助于识别化合物与蛋白质之间的链结构。这样识别辅助结构的结果使得抗体不能与游离的化合物结合或明显地降低了抗体与游离化合物结合的能力。这对于单克隆抗体来说尤其是个问题。如果要将针对化合物的单克隆抗体用于定量分析，那么必须要解决这一问题。令人惊奇的是我们业已发现了可和异硫代伏杀磷化合物共同完成这种作用的抗体，满足了本技术领域的长期的需要。
一旦产生了免疫原结合物，就可以使用它使一种在技术上已知的动物宿主免疫。这样的技术通常涉及到接种，然而也可能涉及到其他的给药方式，要施用足够剂量的结合物，以便在动物宿主体内产生免疫反应。
可利用任何能产生针对结合物的抗体的宿主。按照惯例所使用的动物包括兔子和啮齿类，例如大鼠和小鼠。大鼠和小鼠对本发明来说是比较可取的。
一旦这些动物接受了免疫处理并经过了足够长的时间，它们就开始产生针对结合物的抗体，多克隆抗体可用本技术领域内公知的技术来回收。一般方法包括从动物体内抽出血液并从血液中分离出血清。血清被用作针对异硫代伏杀磷的抗血清，它含有在制备结合物时被用作半抗原的针对异硫代伏杀磷的抗体。换句话讲，可以从这种血清中回收抗体。亲合提纯法是从这种血清中回收被提纯的针对异硫代伏杀磷的多克隆抗体的优选的技术。
单克隆抗体生成细胞是从所述被免疫的动物身上回收的。虽然任意的抗体生成细胞都可以使用，但是从该动物脾脏中所获得的B-淋巴细胞较为可取。
使抗体生成细胞和肿瘤细胞融合以生成杂交瘤。在这里所使用的“肿瘤细胞”这一术语包括任何能与抗体生成细胞融合以生成杂化的“永生”细胞(即能在试管中不断地繁殖的细胞)。较为可取的肿瘤细胞是已被转变并失了产生免疫球蛋白能力的抗体生成细胞。这样的细胞包括犬鼠骨髓瘤细胞的小鼠浆细胞。特别可取的是酶次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HGPRT)中所缺乏的小鼠浆细胞和大鼠骨髓瘤细胞，这种酶使得当在含有次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷的介质中培养时可以从未融合的抗体生成细胞或浆细胞或骨髓瘤细胞中选择出杂化物。
用于同抗体生成细胞融合的各种肿瘤细胞是公知的并且是容易得到的。其中一种这种类型的细胞是在文献Kearney，I.Immunology，123.1548(1979)中所描述的小鼠浆细胞系P3-X63-Ag8.653。另一个细胞系是文献Milstein，J.CellBiology，93∶576-582(1982)中所描述的大鼠骨髓瘤细胞系YB2.0。这些细胞系可从美国典型培养物保存中心得到，在那里，它们的登记号分别为ATCCCRL1580和ATCCCRL1662。
值得注意的是抗体生成细胞和肿瘤细胞可取自不同的动物品种。例如，见文献Nowinski，etal.Sciencl，210∶537(1980)。
如前所述，一旦细胞被融合，必须将杂交瘤从未融合的细胞中分离出来。在培养物中，抗体生成细胞一般几天后就死亡，可是肿瘤细胞却是“永生的”。然而，通过使用在HGPRT中所缺乏的肿瘤细胞并在含有次黄嘌呤、氨嘌呤和胸苷的介质中培养被融合的细胞，可很容易地选择杂交瘤，因为肿瘤细胞在这样的介质中不能存活。然而，其他的已知的筛选技术也可以使用。
选择了杂交瘤之后，对它们进行评估，以确定哪些正在产生针对异硫代伏杀磷的抗体。本技术领域中的普通技术人员所熟知的各种免疫测定法都可以用来评估杂化物的培养物的上清液。必须仔细地鉴定可产生只针对异硫代伏杀磷而不针对异硫代伏杀磷-大分子载体的单克隆抗体的杂交瘤。也就是说，所希望的、有用的、本发明所提供的单克隆抗体是那些可与游离的，即未耦联的或未结合的异硫代伏杀磷反应的抗体。
较为可取的筛选技术是通过免疫测定法(EIA)进行初步筛选，以鉴定出产生针对结合物或针对异硫代伏杀磷的抗体的杂交瘤。而后又借助竟争性抑制酶免疫测定法(CIEIA)对这些杂交瘤加以筛选，以评估游离的异硫代伏杀磷，例如5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷抑制单克隆抗体与异硫代伏杀磷/蛋白质载体结合的能力。根据Hunter等人在文献FE13SLett.194∶147-151(1982)中公开的方法进行CIEIA。
一旦选择出生成单克隆抗体的杂交瘤，就可以用已知的技术从这些杂交瘤中回收这些抗体，无性繁殖一个或多个生成单克隆抗体的杂化物，以将其扩展成为一个可用来定量产生单克隆抗体的传代细胞系。
以前所提到的方法是在试管中进行的方法。在试管中制备针对异硫代伏杀磷的方法包括将产生抗体的杂交瘤通过腹膜注入到组织相容或免疫抑制的宿主体内。这使宿主产生腹水肿瘤，腹水肿瘤本身又产生一种含有杂交瘤所产生的单克隆抗体的液体。经过足够长的时间产生足够多的抗体以后，它们可以用已知技术加以回收。例如可除去腹水并用亲合提纯法回收纯的单克隆抗体。这种方法尤其适合于制备商业用量的单克隆抗体。
正如各种不同的系统和方法都可用来产生与异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体一样，各种单克隆抗体也是由与以下例子所述的抗体截然不同的方法产生的。然而，这些单克隆抗体(其制备也是根据这里的教导才成为可能)也明显地处在本发明的范围之内。对于本发明的目的来说，这些抗体的突出的性质除去它们的单克隆性质之外，就是可以以任意的方式与异硫代伏杀磷反应，而不论物种的起源，同模性、分子特异性、亲合性、产生的方法或在它的制备过程中所使用杂化物的具体类型。
单克隆和多克隆抗体可用来鉴别材料中的异硫代伏杀磷，尤其是5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷以及测定那些材料中的该化合物的含量。这些材料包括诸如土壤、水、食品和体液。当本发明的抗体在各种用于检测是否存在异硫代伏杀磷或测定其浓度的免疫测定法中用作试剂时它提供了一种改进的测定方法。检测是方便、迅速、灵敏和专一的。使用本发明的抗体的免疫测定法包括(但不限于)放射免疫测定。竞争性免疫沉淀测定、酶-联免疫吸附测定和免疫荧光测定法。本发明的单克隆抗体通常是较为可取的抗体，虽然在某些应用中多克隆抗体也是可取的。
用于测定材料中是否存在异硫代伏杀磷或测定其浓度的组合物含有一定浓度的针对该化合物的抗体，这些抗体对于检测该化合物的存在和对其进行定量测定是有效的。抗体可以与适当的载体(例如基质粒子或塑料微滴板)混合或结合。它们也可以根据所用的免疫方法而同酶、染料或放射性标记结合。结果，任何利用单克隆或多克隆抗体和异硫代伏杀磷(包括5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷)的测定系统都包括在本发明中。
单克隆抗体和多克隆抗体还可以用于根据选择性免疫反应从复杂混合物溶液中分离、提纯、中和和/或除去异硫代伏杀磷。使用可与异硫代伏杀磷反应的抗体代表一种对已知方法的一种改进。
单克隆抗体比多克隆抗更为可取。由于单克隆抗体的高度特异性和实质上可无限地获得，它们可以以大工业规模和商业规模加以使用。例如，针对5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷的单克隆抗体可用于从其他异硫代伏杀磷混合物或类似的有机化合物中分离和提纯5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷。混合物被除去后，5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷与抗体分离并用已知技术回收纯品。
用于从复杂的混合物中提纯或除去异硫代伏杀磷的组合物含有固定在可接受基质上或固定在含有可接受载体的混合物中的有效剂量的单克隆抗体，以便与异硫代伏杀磷反应和结合。然而，对某些混合物来说，也许多克隆抗体更为可取。
本发明的单克隆抗体对于涉及异硫代伏杀磷(尤其是5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷)的结构和功能的研究也是很有用的试剂。它们的高度的特异性使得它们可用于对这些化学物质的免疫化学和结构活性的分析，并使它们在这些应用中比特异性小的多克隆抗体更为有效。
这些组合物作为试验剂是很有用的。
实例以下这些非限制性的例子介绍了本发明的几个实施例。
例1A-免疫结合物(651-BSA)的合成在外部冷却条件下，将亚硫酰氯(71.38g，0.6mol)和吡啶(0.5ml)加入到3，3-亚二硫基二丙酸(21.03g，0.1mol)中。该混合物在室温下搅拌过夜。过量的亚硫酰氯在真空中被除去，产生被称为轻琥珀油的3，3′-亚二硫基二丙酰氯(23.7g，100%产率)，它可以不经纯化直接用于下步反应中。
盐酸4-氨基丁酸甲酯(37.2g，0.242mol)和三乙胺(67.8ml，0.486mol)在1，2-二氯乙烷(EDC，300ml)中的混合物在室温下搅拌30分钟。将3，3′-亚二硫基二丙酰氯溶解在50ml的EDC中，在冷却条件下，以滴加方式加到正在受到搅拌的液中，保持在约25℃的温度下，该混合物在室温下搅拌过夜。然后，将该混合物倒入水中并分离出有机层。随后，将有机层依次用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤。然后将溶液进行干燥浓缩成半固态棕色残余物。该残余物在冷却条件下在乙酸乙酯中研磨生成3，3′-亚二硫基-二-N-(3-甲氧基羰基丙基)丙酰胺(化合物Ⅰ)，经过滤和干燥后，是一种灰白色固体(20.4g)。
将化合物Ⅰ环化，生成异硫代伏杀磷。将3，3′-亚二硫基-二-N-(3-甲氧基羰基)丙酰胺(12.0g，0.029mol)和磺酰氯(19.8g，0.147mol)在一小时期间同时加到装有冷却的(0℃)和搅拌的乙酸乙酯(120ml)的烧瓶中。上述酰胺和硫酰氯分别分成24等份，每等份分别为0.5g和0.5ml，每2.5分钟各加一份。在加料过程中形沉淀。加料完毕后，将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后加热到室温。将混合物在室温下搅拌一小时，再冷却到0℃，加以过滤。将该固体溶在水中，用三氯甲烷萃取。用水洗涤三氯甲烷层，而后用盐水洗涤。一旦三氯甲烷被烘干，该溶剂就被除去，就产生5-氯-2-(3-甲氧基羰基丙基)-3-异硫代伏杀磷，一种白色固体(产量8.9g，熔点54-6℃)。
异硫代伏杀磷的甲基酯被水解成游离酸。将5-氯-2-(3-甲氧基羰基丙基)-3-异硫代伏杀磷(4.0g)溶解在6ml的醋酸中。在室温下向这一被搅拌的溶液中加入6M盐酸水溶液(7ml)，然后在室温下将此溶液搅拌24小时，在此期间生成白色沉淀。将溶液加以过滤，滤液进一步加以浓缩，生成更多的同样的沉淀[5-氯-2-(3-羟基羰基丙基)-3-异硫代伏杀磷)]。合成的产量是2.95g(熔点158-161℃)。
而后，将游离酸异硫代伏杀磷耦合到牛血清清蛋白(″BSA)上。将5-氯-2-(3-羟基羰基丙基)-3-异硫代伏杀磷(0.45g，0.002mol)和n-BU3N(0.95g，0.0051/mol)倒入二噁烷(5ml)中。将异丁基氯甲酸醋(0.77g，0.0056mol)在0℃下逐滴加入被搅拌的悬浮液中。随着异丁基氯甲酸酯的加入，悬浮物被溶解。将此溶液在室温下搅拌1小时。这样就生成了异硫代伏杀磷-异丁基氯甲酸酯混合酐，它可以不经分离而使用。将BSA溶解在去离子水(20ml)中随后加入少量的二噁烷(1ml)。将异硫代伏杀磷-异丁基氯甲酸酯混合酐溶液在0℃下逐滴加在这一被搅拌的BSA溶液中。加料速度控制在反应温度保持0℃。加料完成后，将该混合物在℃搅拌1小时，然后再加热至室温，在室温下搅拌1小时。将该混合物转移到渗析袋中并渗析24小时，然后进行低压冷冻干燥以除去水。结果，得到一种轻的、白色粉末(651-BSA组合物)(2.9g)。
例1-免疫BALB/C小鼠可从(TaconicFarms，NewYork，USA)得到的并根据表1中所述的时间表用前边例子中所制备的651-BSA结合物使其免疫，在该表中，CFA表示“完全弗洛因德佐剂”IFAM表示“不完全弗洛因德佐剂”，PBS表示“生理缓冲盐水”，“SG”表示皮下的“iP”表示腹膜内的。
表1天日期剂量佐剂途径112/7/88300μgCFAsc632/8/89150μgIFASC1194/5/89100μgIFASC31410/17/89100μgIFASC4031/14/9050μgIFASC4994/20/9030μgPBSiP4994/20/9020μgPBSSC5737/3/90100μgPBSiP例2-融合所有的技术都要在无菌条件下完成并使用无菌试剂。将一只产生多克隆抗体的小鼠用过量的麻醉剂(Rompum
/Ketamine
)杀死。切下脾脏，将其放在含有20ml ABC介质(Cell Enterprises，Harrisonburg，VA)100mm的培养皿中。用10mlABC介质灌注该脾脏以除去大部分脾细胞。用21号针梳理脾囊从而得到剩余的细胞，体积随着ABC介质的加入达到约50ml，取0.1ml样品并按1∶50的比例用ABC介质将样品稀释、被稀释的细胞在血细胞计数器中以获得取自脾脏的淋巴细胞的大致数目。在此期间，细胞通过在室温下按大约200×g的速度离心分离5分钟被压成片状。
从该脾脏得到大约1.2×108个淋巴细胞。这些细胞同1.2×107个骨髓瘤细胞(SP2/O-AG14，ATCC Cat(RL1581)相混合。这些细胞借助离心分离(在室温下以大约250×g的速度进行10分钟)，再次被压成片状。除去上清液至接近干燥的程度，通过轻轻拍打离心试管以使所述片状细胞松开而使这些细胞重新悬浮起来。
而后，将这些细胞用1ml50%聚乙二醇(分子量为1500，PEG)(已经预先加热至36℃)加以处理，在约75秒的一段时间内缓慢地(逐滴加入)加入PEG，同时不断转动离心试管以保证剩余细胞在同PEG接触时得以充分混合。
而后，将含有这些细胞的离心试管在37℃水浴中放置1分钟。然后将离心试管从水浴中取出，在以后的60-75秒中逐滴加入1ml热的ABC介质，同时不断转动离心试管，以保证这些细胞以及PEG能同介质充分混合。接下去这些细胞又被移入37℃水浴中放置1分钟，而后从水浴中取出。在以后的60-75秒的时间内加入2mlABC介质，同时如前所述不断转动离心试管。接下去这些细胞再次被转移到37℃水浴中放置1分钟。从水浴中取出离心试管;加入4ml热的ABC，同时如前所述不停转动离心试管，将这些细胞在在室温下培养1分钟，而后加入8ml热的ABC介质，如前所述不断转动离心试管。接下去细胞在室温下培养1分钟，而后加入12ml热的ABC介质，如前所述不断转动离心试管。最后，通过加入ABC介质使体积达到50ml。
所述细胞如上所述通过离心作用被压成片状。将介质抽掉，使这些细胞又重新悬浮在60ml的HM[ABC，69%;出自GIBCO的AIMV介质补充剂(产品目录＃320-2055PK)，20%FBS，1%;杂化物增强补充剂(取自Sigma，产品目录＃H8142)，5%;取自骨髓瘤细胞的调节介质，5%;2-巯基乙醇，25mM]中。然后将这些细胞分成两等分，每份30ml，一份中加有内皮细胞生长补充剂[ECGS(取自Sigma，产品目录＃E2795)，5μg/ml]而另一份没有再加补充剂。
细胞被放入几个有96个穴的点滴盘中，每个穴中放100μl。标记为A、B、C的盘放入不含ECGS的细胞，含有ECGS的那些细胞放在标记为D、E、F的盘中。这些细胞在含有5%的CO2的潮湿的空气中加以培育。
融合一天后，向每一个穴加入100μl×HAT介质(在含有或不含适合的ECGS的HM中制备)，(HAT是次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷的混合物，用于该培养物介质的最终浓度是5×10-3的次黄嘌呤，2×10-5M的氨喋呤，1×10-4M的胸苷)。而后，这些细胞静止保温144小时，接下去向每一个穴中加入不含HAT，但是含有或不含适合的ECGS的HM50μl。
融合约14天后，对存在有杂交瘤生长菌落的盘进行计数。结果见表Ⅱ。
表Ⅱ具有生长杂交瘤的穴的百分比盘带有菌落的穴涂过的穴ECGS穴百分比W1CO1A3996-40.6B5196-53.1C3096-31.3D4496+45.8E4796+49.0F4094+41.2A-C的菌落/盘平均百分比41.6D-F菌落/盘平均百分比45.5A-F菌落/盘平均百分比43.6例3-筛选抗体上清液用酶联免疫测定法(EIA)筛选取自带有杂交瘤生长菌落的穴中的上清液。按100μl/穴的用量用结合有BSA的(651-BSA)在室温下涂敷带有96个穴的聚苯乙烯EIA盘至少放置2小时或在4℃温度下放置16小时。用PBS-T洗涤五次以便将未结合的物质从那些穴中洗去。然后向穴中加入50μlPBS-T。将50μl上清液或培养物介质(阴性对照)加入到穴中，在室温下保温30-60分钟，然后，用PBS-T洗涤穴五次以除去未结合的物质，随后向每一个穴中加入100μl1mg/ml的生物素化抗小鼠IgG(VectorLaboratoies，Burlingame，CA)溶液。这些穴再次在室温下保温30-60分钟，而后用PBS-T洗涤5次以除去未结合的材料。然后向每一穴中加入100μl抗生物素蛋白生物素化辣根过氧化酶复合物(AB复合物;VectorLaboratories。AB复合物的抗生物素蛋白部分具有非凡的高度亲合性，同生物素化马抗小鼠IgG的抗生物蛋白部分结合而形成一个稳定的含酶复合物)。在室温下保温30-60分钟后，未结合的试剂再用PBS-T从穴中洗去并向每个穴中加入100μlABTS底物(K&P)。30-60分钟后用FLOWTitertekMultiscan340EIAPlatereader测定吸收度(414nm)。
对杂化物上清液进行筛选，暴露出二个可以与该涂层抗原反应的菌落生成抗体。这些菌落标记为89-147EH9和89-147ECL。将这些培养物扩大并加以低温保存，利用如下所述的竞争性抑制ELISA法(酶联免疫测定法)对它们进一步评估。
例4-竞争性抑制ELISA法用CIEIA法筛选上清液(取自带有杂化物生长菌落的一些穴中)。96穴聚苯乙烯EIA(酶抑制测定)点滴盘每穴涂上100μl结合有BSA的651(651-BSA)，在室温下放置2小时，或在4℃放置16小时。未结合的物质用PBS-T洗涤5次，将其从穴中洗去。然后向每个穴中加入50μl只含(PBS-T)的缓冲剂或抑制剂651或573(每一种用缓冲剂稀释至2ppm)。而后，向每个穴中加入50μl取自每种细胞培养物的上清液，结果每一种上清液与缓冲剂或抑制剂651或573之中之一反应。等体积的上清液和抑制剂(或缓冲剂)的组合导致上清液最终按1∶2稀释，抑制剂的最终的深度为1ppm。这些穴在室温下保温30-60分钟。然后将它们用PBS-T洗涤5次以除去未结合的物质，而后再向每个穴中加入100μl1μg/ml的生物素化马抗小鼠IgG(VectorLaboraties，Burlingame，CA)，该方法如关于ELISA在前边所述的那样继续下去。
如果上清液中的抗体可同穴中溶液的一种或两种抑制剂反应，那么抗体分子或一部份抗体分子会与抑制剂结合，形成抗体-抑制剂复合物，这种复合物将处在溶液中并在洗涤阶段被从点滴盘上清除掉。在这种情况下，抗体与抑制剂的结合会减少可用来与涂层抗原651-BSA结合的抗体分子的数量。由于结合到651-BSA上的抗体分子比较少，就减少了被结合的生物素化物马抗小鼠IgG分子的数量，结果使得被结合的抗生物素蛋白-过氧化酶的复合物的分子比较少，导致底物水解作用的降低，归根结底使吸收度降低。
通过改变涂层抗原、抗体和检测分子(例如马抗小鼠IgG以及抗生物素蛋白-过氧化酶复合物)的浓度控制CIEIA以达到较强抑制作用是可能的。利用这样的CIEIA的“优化”能获得较高的灵敏度并允许使用较低浓度的(或较高稀释度的)单克隆抗体。
在利用CIEIA法进行试验时，只有细胞培养的89-147EH9能始终如一地同涂层抗原反应并被化合物651和573抑制。典型的CIEIA的数据如表Ⅲ所示。
表Ⅲ-培养物上清液CIEIA培养物ID上清液稀释抑制剂(吸收度)1PPM1PPM无651573CF101:20.4850.4190.479EH91:20.1700.1500.117EC21:20.8470.6520.520培养物介质0.2910.3000.305EC21:120.9170.9100.872EH91:2.50.3860.1220.135CF101:2.50.1210.1190.099EC2 IB8*1:6 0.169 0.124 0.121培养物介质0.1080.1000.098EH9 1:4 0.515 0.186+0.504+＊89-147EC2无性系＊相对于0.4ppm的抑制剂检测的为了证明细胞培养物89-147EH9所产生的抗体优先同化合物651反应，如上所述进行CIEIA，不同之处在于含有抗体的上清液同四种不同的抑制剂反应，每一种具有几个不同的浓度。该方法的结果如表Ⅳ所示。本发明的抗体与651反应比与其他被检测的化合物的反应更为强烈，如同利用651比利用同样数量的其他生物杀伤剂抑制作用更强这一实验所证实的那样。
表Ⅳ-用于检测生物杀伤剂的CIEIA法抑制剂浓度10分钟吸收度×1000ppm651573NMA89350 ND*191 490 5161010634451858921855044965140.4338461519ND0.08448590429ND0.016491NDNDND无515n=3＊ND＝不检测NMA＝N-甲基丙酰氨例Ⅴ-杂交瘤的无性繁殖为了确保与化合物651反应的抗体是由具有相同遗传性质的细胞制备的，必须衍生出细胞培养物89147EH9的无性系。要完成无性繁殖首先要测定S9-147EH9细胞簇中存活细胞的总数。然后将该细胞簇稀释到每毫升细胞培养物介质中含有4-5个细胞的密度。将200μl这种细胞的悬浮液植入四个有96个穴的细胞培养盘的每一个穴中。命名为Ⅰ-Ⅳ。14天以后，用显微镜观察细胞的生长菌落，只有带有单光程焦点的那些细胞被认为是单克隆的。无性繁殖过程的结果在下面表Ⅴ中。
表Ⅴ-细胞培养物89-147EH9的无性繁殖板带有菌落具有单光程具有单光程焦ID的穴数焦点的穴数点的百分比%I151173.3II171270.6III191789.5IV181372.2合计:17.25+/1.713.25+/-2.676.4+/-8.8随后，按照前面所述的酶联免疫测定法(ELISA)对每一个菌落测定其反应性。选择其中的几个菌落进行扩大并利用CIEIA法重新检测它与651和573两者的反应性。这个测定的结果列在下面表Ⅵ中。
表Ⅵ-CIEIA89-147EH9不育系与化合物651和573的反应性吸收度×1000无性系标志 PBS. 651 1PPM %I*573 1PPM %IIAS52834834.147110.8IID1060055<1.0057<1.0ID558442926.56710.0IVF1209006527.807318.9ID87468070.010680.0IVE181845244.753934.1IIIH664747127.27050.0IVE459536139.35399.4IVH268036646.26327.0只有介质063059<1.0058<1.0＊%I＝抑制百分比，将利用每一种抑制剂(651或573)所得到的吸收度除以未受抑制的吸收度(PBS)并用1减去上述商，所得差乘以100，得出所述抑制百分比。负值被表示为0.0。
以这些结果和随后的测定为基础，将无性细胞系89-147EH9ⅢH6加以扩大、象腹水那样加以培养，然后加以提纯并用于以后的测定。
例6-651的定量CIEIA法为了证明CIEIA法对于检测未知样品中651的浓度的实用性，进行了一次定量免疫测定。这次测定是按照例子所述那样进行的，区别在于抗体的复制样品与一系列已知浓度的化合物651反应，也与含有未知量的651的样品的几种稀释液反应。如例4所描述的那样，在651浓度被提高时，该抗体与651的相互作用最强，最终导致吸收值的减小。中等水平的651引起吸收值的中等程度的减小，低水平的651所引起的吸收值的减小很少，或未引起减小。
在定量的CIEIA中，通过作吸收值对651浓度的对数曲线而产生了一条标准曲线。这些点的拟合是采用回归分析法、四参数对数曲线拟合法以及其他统计方法。而后，通过将未知样品与抗体进行反应所处的那些穴中的吸收值与根据标准曲线所得到的吸收值相比较来确定在未知样品中651的浓度。
这些方法用于估算在实验室配制的造纸厂废液、冷却塔水和金属作业废水样品中的651的浓度，这些样品在使用时都要稀释。测定结果如表Ⅶ所示，并附有样品中的真实浓度，这些结果表明这种测定方法可以用来成功地估算样品中651的含量水平。
表Ⅶ651浓度的估算样品 Nominal651(PPM)1HPLC(PPM)2CIEIA(PPM)3造纸厂7.58.45.42.252.53.20.3750.411.3冷却塔7.58.46.52.252.52.30.3750.411.3MWF22.521.22011.259.911.23.753.30.741.Nominal是样品的预定值2.HPLC是目前使用的标准分析方法3.CIEIA样品在分析前以1∶4比例稀释第二组实验室制备的冷却塔水样一式两份用CIEIA法分析651含量，接下去是如以上例4所述步骤。这些结果列在表Ⅷ中，
表Ⅷ冷却塔水中651浓度的估算CIEIANominalHPLC单个样品重复样品109.310.411.732.83.36.5σ.50.46nd*0.46＊Nd＝末检品例7-ELISA测试盒A.测试条规格在该测试条盒的设计中，一个塑料片固定在一个瓶盖上，以便它向下悬在瓶中。在该测试条的表面是2cm2的检测区域，在这一区域上设置有100mg抗-651抗体。样品稀释到装有651-BSA结合物(200mg)的溶液的瓶中。将带有测试条的瓶盖拧到这个瓶上，保温大约15-30分钟。取出该测试条并用水或缓液冲洗，而后再将盖拧在装有抗生物素蛋白-HRP(辣根过氧化酶)复合物的小瓶上并保温15分钟，然后漂洗。而后再将该测试条放入装有HRP底物(例如过氧基-双-乙基噻唑啉磺酸(“ABTS”)的小瓶。经过一设定的保温时间后，通过观测小瓶中兰色的深度来估算异硫代伏杀磷的浓度。
B.膜的规格将抗-651抗体设置在一个膜上并将这膜(约2cm2，含有100mg抗体)放在一个小杯上面。样品同651-BSA-生物素结合物(由该样品的1∶2稀释构成，结合物的总量是200mg)相混合并将这溶液倒在该膜上。重力使溶液通过该膜。接下去将抗生物素蛋白-HRP倒在该膜上，漂洗，然后将检测溶液(HRP底物)倒在该膜上。通过测定该膜上兰色的深度估算异硫代伏杀磷的浓度。
例8-木材中异硫代伏杀磷的比色测定SonhernYeHow松树已经利用工业方法使用含有4，5-二氯-2-辛基-3-异硫代伏杀磷的溶液进行过加压处理，将其切成薄片(0.5×2.5cm)。将这些木材在3%的脱脂牛奶溶液中浸泡30分钟，然后迅速地用PBS-T漂洗并在其后将它暴露在抗-651抗体(该抗体按500mg/ml的量与辣根过氧化酶共价连接)15分钟。而后用PBS-T缓冲液洗涤该木片两次，每次30分钟。通过将该木材片放在装有HRP底物(ABTS)的小瓶中目测被结合的抗051-HRP复合物。溶液中出现兰色表明存在4，5-二氯-2-n-辛基-3-异硫代伏杀磷。从小瓶取出200μl份溶液并在405nm处测定其吸收度。将此木材片，同以相同方式处理过，但不含异硫代伏杀磷的对照木材片加以比较，然后校正吸收值的背景干扰。
样品A405对照的0.002经过处理的0.165这些数据表明该方法可用于测定木材或固体基质中异硫代伏杀磷的浓度。
权利要求
1.一种制备异硫代伏杀磷和大分子载体的免疫原结合物的方法，该方法包括将一个化学链以共价键方式结合到大分子载体上，将含有反应基的异硫代伏杀磷衍生物以共价键方式结合到该化学链上。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的异硫代伏杀磷是5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷。
3.一种制备与异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体的方法，该方法包括用根据权利要求1所制备的免疫原结合物使一种动物免疫;从该动物体内取得抗体生成细胞;用肿瘤细胞融合所述细胞以产生杂交瘤;从所述杂交瘤中选择出至少一种能产生可与异硫代伏杀磷反应的抗体的杂交瘤;以及从所选择的杂交瘤中回收所述的生成的抗体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述动物是啮齿类动物。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的肿瘤细胞是小鼠浆细胞或大鼠骨髓瘤细胞。
6.如权利要求3所述方法，其特征在于所述的杂交瘤具有ATCCSD1425或其突变体或变体的特征。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的动物是小鼠;从所述小鼠的脾脏中回收抗体生成细胞;用在酶次黄嘌呤转磷酸核糖基酶中所没有的小鼠浆细胞或大鼠骨髓瘤细胞融合所述抗体生成细胞以产生杂交瘤;通过在包括次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷的介质中的培育选择出至少一种所述杂交瘤，鉴定出至少一种可产生游离的或未被结合的针对5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷的抗体的所述杂交瘤;培养被鉴定出的所述杂交瘤以产生可回收数量的所述抗体并回收由所述被培养的杂交瘤所产生的抗体。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于该方法包括通过腹膜将产生所述的杂交瘤注入组织相容的或免疫抑制的宿主体内并从所述宿主的腹水中回收抗体。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于该方法包括将所选择的杂化物以无性繁殖的方式扩大成传代细胞系。
10.一种检测在一个组合物中异硫代伏杀磷的存在和浓度的方法，该方法包括采用以根据权利要求3所制备的单克隆抗体作为试剂的一种免疫测定法。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于该方法进一步包括从混合物中分离出或除去异硫代伏杀磷。
12.如权利要求11所述的方法，该方法包括以被提纯的形式回收所述异硫代伏杀磷。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述免疫测定法可用于异硫代伏杀磷的生化、免疫、功能或检测分析。
14.如权利要求1所述方法，其特征在于该方法还进一步包括用所述的结合物使一个动物免疫;从所述动物体内抽取血液;从所述血液中分离出血清;以及从所述血清中回收多克隆抗体。
15.一种检测样品中是否存在异硫代伏杀磷或测定其浓度的方法，包括用根据权利要求14制备的多克隆抗体作为试剂的免疫测定法。
16.一种组合物，包括一种能产生与异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体的杂交瘤。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于所述异硫代伏杀磷是5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷。
18.如权利要求16所述的组合物，其特征在于所述杂交瘤具有ATCC SD1425或其突变体或变种的特征。
19.一种组合物，包括可与异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体或多克隆抗体。
20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于所述的单克性抗体可以从传代细胞系或杂交瘤中回收。
21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于所述的杂交瘤具有ATCC SD1425或其突变体或变种的特征。
22.根据权利要求20所述的组合物，其特征在于所述组合物被固定在一种基质上或含有载体的混合物中。
23.一种组合物，包括由权利要求1的方法制备的免疫原浓缩物。
全文摘要
本发明公开了以可与异硫代伏杀磷(尤其是5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷)反应的单克隆抗体为基础的免疫测定法，产生这样抗体(特别是ATCC SD1425)的杂化物，制备异硫代伏杀磷与大分子载体免疫原结合物的方法；制备可与异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体的方法；以及一些可与异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体和多克隆抗体的组合物。
文档编号G01N33/53GK1090929SQ9311984
公开日1994年8月17日 申请日期1993年9月28日 优先权日1992年9月28日
发明者G·L·威林哈姆, R·F·舒曼, C·H·黄, J·S·查普曼 申请人:罗姆和哈斯公司