一种管内固相微萃取技术用于牛奶中磺胺类抗菌药的快速检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及磺胺类抗菌药的检测方法，特别是涉及一种采用管内固相微萃取-毛 细管电泳-激光诱导荧光检测联用技术检测磺胺类抗菌药的分析方法，属于分析化学-食 品安全检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 磺胺类抗菌药是一类具有广谱抗菌活性的化学药物（SAs)，被广泛应用于畜牧业 上细菌感染性疾病的预防和治疗，低剂量使用还可促进畜禽生长。但过度使用该类药物会 导致动物性食品的药物残留，甚至会引起过敏反应和癌变，进而危害人类的健康。为保证人 类的食品安全，许多国家对食品中SAs的残留制定了最高允许量，我国农业部发布的《动物 性食品中兽药最高残留限量》规定磺胺类药物在动物源性食品中的最高残留限量（MRLs)为 100ug/kg。因此，磺胺类抗菌药的检测对食品安全的质量监控至关重要。
[0003] 目前用于磺胺类抗菌药的检测方法主要有生物检测法，免疫分析法，色谱法，色/ 质谱联用技术等。其中微生物检测法检测速度快，但灵敏度和准确度不高，且只能定性检 测；免疫分析技术是一种粗筛选方法，杂质干扰大的动物源性样品的检测结果会不准确，且 其难以解决非特异性吸附的问题；薄层色谱法虽然选择性好，但重复性差；高效液相色谱 法较为通用，具有高灵敏度和低检出限等优点，但其样品预处理时间较长、操作复杂，不适 宜作为药物残留的快速检测；而色质联用技术综合了色谱的高分离能力和质谱的高定性能 力，但质谱仪器较为昂贵，对操作人员的要求也较高，限制其应用范围。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种快速、准确检测牛奶中磺胺类 抗菌药的方法，即管内固相微萃取-毛细管电泳-激光诱导荧光检测联用技术。这是一种 利用石墨烯嵌入的多孔聚合物整体柱作为管内固相微萃取的固定相对目标分析物进行高 效富集，并采用高灵敏度、低检测限的激光诱导荧光检测器检测磺胺类抗菌药的检测方法。 本方法分离检测步骤仅需3min，磺胺类抗菌药的检测限能达到20yg/L，实际样品中定量 浓度可低至3.7yg/L，回收率在91. 1% -93. 8%之间，可以满足食品样品的检测要求。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006] -种管内固相微萃取-毛细管电泳-激光诱导荧光检测联用技术快速检测牛奶中 磺胺类抗菌药（磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶）的方法，包括如下步骤：
[0007] S1.待测样品前处理：
[0008] 准确量取l-5mL牛奶，加入10-40mmol/L、pH= 3-6的磷酸盐溶液稀释至10-50mL， 涡旋混匀，离心，取上清液，再经滤膜过滤后备用。取l_5mL上清液至5mL棕色小瓶中备用。
[0009] S2.样品的管内固相微萃取：
[0010] 取经步骤1处理后的牛奶的上清液1-500UL于一小瓶中，在压力驱动下，待测样 品溶液进入萃取柱，目标分析物被留在毛细管内的萃取相上，在流出端放置一离心管收集 流过萃取柱的溶液。
[0011] S3.样品的解析：
[0012] 取5-50yL解析溶剂，在压力驱动下，解析溶剂进入萃取柱，将萃取柱上的目标分 析物洗脱，流出端的离心管收集洗脱下的目标分析物。
[0013] S4?样品的衍生：
[0014] 将收集到的含有目标分析物的解析溶剂加入5-50yL乙酸盐溶液，再加入 0? 2-2yL荧光胺衍生试剂，在20-50°C衍生10_40min。
[0015] S5?样品的检测：
[0016] 经衍生后的目标分析物溶液通过液位差法进样，再经毛细管电泳-激光诱导荧光 检测器分离检测待测样品中磺胺类抗菌药，并用外标法定量。
[0017] 所述的检测方法，其中，步骤1中牛奶样品的过滤使用0. 22ym的Nylon滤膜。
[0018] 所述的检测方法，其中，步骤1中离心的转速是5000-15000r/min，离心的时间 10_30minD
[0019] 所述的检测方法，其中，步骤2中所使用的管内固相微萃取多孔聚合物整体柱的 制备方法如下：
[0020] 本发明中石墨烯嵌入的甲基丙烯酸类多孔聚合物整体柱的制备采用光引发原位 聚合的方法，将含有石墨烯的有机聚合物溶液注入到硅烷化的毛细管中，在紫外光催化/ 反应箱中反应10-60min，即可得到所需的整体柱。实验室制备的有机聚合物溶液由功能单 体、交联剂、致孔剂、引发剂和石墨烯构成，其中功能单体为甲基丙烯酸正丁酯，交联剂为乙 二醇二甲基丙烯酸酯，致孔剂为N，N-二甲基甲酰胺和聚乙二醇6000,引发剂为安息香双 甲醚。实验中通过改变单体与致孔剂的比例、功能单体和交联剂的比例以及致孔剂中两种 组分的比例来调节孔径和粒径都符合要求的整体柱，以实现合适的渗透性和比表面积的目 的。选用的毛细管内径为25-500ym。通过SEM表征有石墨烯的存在以及良好的多孔结构。
[0021] 所述的检测方法，其中，步骤2中萃取施加的压力为100-500psi。
[0022] 所述的检测方法，其中，步骤3中解析施加的压力为100_500psi。
[0023] 所述的检测方法，其中，步骤3中解析溶剂是60% -100%甲醇水溶液，百分比为体 积百分比。
[0024] 所述的检测方法，其中，步骤4中加入乙酸盐的pH值为2-5。
[0025] 所述的检测方法，其中，步骤5中分离的毛细管为25-500ym内径、15-50cm总长 (有效长度l〇-45cm)熔融石英毛细管。
[0026] 所述的检测方法，其中，步骤5中采用液位差进样，进样高度为5-lOcm，进样时间 为 5-20s。
[0027] 所述的检测方法，其中，步骤5中毛细管电泳分离条件：分离缓冲溶液为 20-100mmol/L、pH= 5-9的磷酸盐缓冲溶液，分离电场强度为100-500V/cm。
[0028] 本发明可以获得如下效果：
[0029] 本发明提供了一种利用管内固相微萃取-毛细管电泳-激光诱导荧光检测联用技 术快速检测磺胺类抗菌药的方法，该方法采用管内固相微萃取技术对样品进行前处理，并 采用高灵敏度、低检测限的激光诱导荧光检测器检测。是一种将富集、分离、检测于一体的 新型绿色环保的分析方法。
[0030] 本发明中所述的管内固相微萃取柱是通过光聚法制备的石墨烯嵌入的甲基丙烯 酸类多孔聚合物整体柱，石墨烯的加入显著增加了萃取柱的比表面积和稳定性，其与许多 有机物质能发生共轭作用，提高了萃取柱的萃取容量。该萃取柱还具有良好的渗透 性和低传质阻力的特点。其可以实现对复杂样品体系中目标分析物的快速、高效的富集。
[0031] 利用本发明中所述的管内固相微萃取柱对待测样品进行萃取，得到的解析液经衍 生后直接进行毛细管电泳分离-激光诱导荧光检测，能够方便、快捷的检测出待测样品中 微量甚至痕量的目标分析物。本发明通过衍生产生荧光进行检测提高灵敏度，减少物质干 扰。该方法对牛奶中磺胺类抗菌药的检测范围为20-500yg/L，且线性良好，线性相关系数 (R2)为0. 9983-0. 9993,检出限为20yg/L，满足低残留量时的检测要求。
【附图说明】
[0032] 图1是本发明制备的石墨烯嵌入的甲基丙烯酸正丁酯-乙二醇二甲基丙烯酸聚合 物萃取柱的800倍扫描电镜图。
[0033] 图2是本发明制备的萃取柱的4000倍扫描电镜图。
[0034] 图3是本发明的萃取装置示意图。
[0035] 图中，1.样品离心管，2.多孔聚合物萃取柱，3.收集离心管。
[0036] 图4是100yg/L的三种磺胺类抗菌药混合标准溶液萃取解析后的电泳谱图，出峰 顺序为磺胺二甲基嘧啶（SMZ) :2. 053min;磺胺甲嘧啶（SMR) :2. 373min;磺胺嘧啶（SDZ): 2. 767min〇
[0037] 图5是磺胺二甲基嘧啶定量标准曲线。
[0038] 图6是磺胺甲基嘧啶定量标准曲线。
[0039] 图7是磺胺嘧啶定量标准曲线。
[0040] 图8是牛奶样品萃取解析后与未萃取的电泳谱图。
【具体实施方式】
[0041] 为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面结合附图与具体实