4混合液；图2A为正常隐球菌与小鼠白细胞混悬液，图2B为热灭活隐球菌与小鼠白细胞混悬液。根据流式细胞检测结果可知混合液中含有隐球菌8.03X 105/ml,白细胞1.83X 105/ml，与原始混合液配比基本一致。
【具体实施方式】
[0044]现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。以下就本发明所提供的一种检测隐球菌活力试剂盒和检测方法做进一步说明。
[0045]实施例1:制备本发明的试剂盒
[0046]本发明的试剂盒各成分信息如下
[0047]检测液A 为 3.5% (w/v)CFff (Calcofluor white,购自 Sigma-Aldrich 公司，货号F3543)保存液:1.75mg CFW溶于0.5ml双蒸水，NaOH调节pH至10，避光管保存。
[0048]所述检测液B为1% (w/v)PI (Propidium 1dide,碘化丙卩定，上海将来试剂,货号A007233)保存液:0.5mg PI溶于0.5ml双蒸水中，避光保存。
[0049]所述稀释液C为:磷酸氢二钠2.6g，磷酸二氢钠0.43g，氯化钠8.18g，定容到1000ml，调节pH至7.2，取50ml分装。
[0050]实施例2:脑脊液中隐球菌活力检测
[0051]1.相关试剂配制
[0052]相关试剂配制参照实施例1
[0053]2.检测过程
[0054]2.1隐球菌脑膜炎脑脊液常规检查过程中留取将脑脊液样本5ml，1000转/分水平离心机离心5分钟,弃上清液,加入稀释液C200 μ I,重悬,制成待测标本；
[0055]2.2将200 μ I重悬的标本振荡后进行流式细胞检测调零(图1Α)；
[0056]2.3在2.2调零后的标本中加入5 μ I检测液Α，再次上机检测，吸样量为30 μ 1，回避细胞碎片，选取大小正常的细胞群体进行分析进行，采用FLl和FL4通道检测荧光；
[0057]2.4在2.3的样本中加入5 μ I检测液B，再次上机检测，至少记录10000个细胞，获得流式细胞数据，用Flowjo分析软件，在PI_Cy5-A/V1Blue-A双参数点图中进行设门调難
iF.0
[0058]3.结果
[0059]结果见图1B
[0060]四分门左下象限代表脑脊液中有活力的宿主细胞(21.3%)，右下象限代表脑脊液中有活力的隐球菌(54.4%)，左上象限代表脑脊液中死亡的宿主细胞(0.24%)，右上象限代表脑脊液中死亡的隐球菌(24%)。由此可计算脑脊液中69.4%的隐球菌未死亡。
[0061]实施例3:本发明检测方法敏感性和特异性检测
[0062]1.相关试剂配制
[0063]相关试剂配制参照实施例1
[0064]2.实验样本准备
[0065]2.1采用眼眶取血方法取小鼠外周血0.5ml，红细胞裂解液裂解红细胞，100rpm离心后稀释液C重悬，用血细胞计数板将白细胞调整至IX 106/ml。
[0066]2.2将培养的隐球菌用稀释液C重悬后,稀释成lX106/ml菌悬液。取0.5ml该浓度菌悬液备用，再取0.5ml菌悬液90°C水浴灭活lOmin。将正常菌悬液和灭活菌悬液分布与2.1中白细胞悬液按4:1比例混匀，配置成IXlOfVml混合细胞悬浮液A和B (白细胞:隐球菌为1:4)。
[0067]3.实验样本检测
[0068]3.1各取2.2中细胞悬浮液A和细胞悬浮液B0.5ml，将其振荡后进行流式细胞检测调零；
[0069]3.2在3.1调零后的样本中加入5 μ I检测液Α，再次上机检测，吸样量为30 μ 1，回避细胞碎片，选取大小正常的细胞群体进行分析进行，采用FLl和FL4通道检测荧光；
[0070]3.3在3.2的样本中再加入5 μ I检测液B，再次上机检测，至少记录10000个细胞，获得流式细胞数据，用Flowjo分析软件，在PI_Cy5-A/V1Blue-A双参数点图中进行设门调難
iF.0
[0071]4.结果
[0072]细胞悬液A结果为图2A，细胞悬液B结果为图2B。
[0073]图2A为小鼠白细胞与未灭活隐球菌1:4混合的细胞悬液，左下象限代表细胞悬液中有活力的白细胞(21.5%)，右下象限代表脑脊液中有活力的隐球菌(76.2%)，左上象限代表脑脊液中死亡的宿主细胞(0.192%)，右上象限代表脑脊液中死亡的隐球菌(2.12%)。结果与细胞悬液配置比基本一致。
[0074]图2B为小鼠白细胞与灭活隐球菌1:4混合的细胞悬液，左下象限代表细胞悬液中有活力的白细胞(18.3%)，右下象限代表脑脊液中有活力的隐球菌(0.791%)，左上象限代表脑脊液中死亡的宿主细胞(0.638%)，右上象限代表脑脊液中死亡的隐球菌(80.3%)。结果与细胞悬液配置比基本一致。
[0075]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
【主权项】
1.一种隐球菌活力检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒是用流式细胞学方法检测隐球菌活力和数量，该试剂盒包括下列试剂: 检测液A:3.5%w/v的荧光增白剂，pH值为10 ； 检测液B:l%w/v的核酸染色剂碘化丙啶； 稀释液C =PBS稀释缓冲液，pH值为7.2。
2.根据权利要求1所述的一种隐球菌活力检测试剂盒，其特征在于，所述的检测液A:1.75mg荧光增白剂溶于0.5ml双蒸水，NaOH调节pH至10，避光管保存。
3.根据权利要求1所述的一种隐球菌活力检测试剂盒，其特征在于，所述的检测液B:0.5mg碘化丙啶溶于0.5ml双蒸水中，避光保存。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种隐球菌活力检测试剂盒，其特征在于，所述的稀释液C:磷酸氢二钠2.6g，磷酸二氢钠0.43g，氯化钠8.18g，定容到1000ml，调节pH至7.2。
5.根据权利要求4所述的一种隐球菌活力检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒，包括:Iml的检测液A、Iml的检测液B和50ml的稀释液C。
6.一种利用权利要求1所述的隐球菌活力检测试剂盒的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: A、将含隐球菌的样本悬液离心1000转/分钟，5分钟，去上清；用稀释液C将沉淀稀释至16个/ml，制成待测标本； B、将待测标本振荡后进行流式细胞检测调零，调零后的标本中加入检测液A，上机检测，并进行圈门； C、在步骤B的样本中加入检测液B，再次上机检测，至少记录10000个细胞并加以记录和统计分析。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤B中采用FLl和FL4通道检测荧光。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤C获得流式细胞数据，用Flowjo分析软件，在PI_Cy5-A/V1Blue-A双参数点图中进行设门调整。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，该方法包括下述步骤: 步骤一试剂制备: .1.1、检测液A为3.5%w/v的荧光增白剂保存液:1.75mg荧光增白剂溶于0.5ml双蒸水，NaOH调节pH至10，避光管保存；.1.2、检测液B为l%w/v的碘化丙啶保存液:0.5mg碘化丙啶溶于0.5ml双蒸水中，避光管保存； .1.3、稀释液C为:磷酸氢二钠2.6g，磷酸二氢钠0.43g，氯化钠8.18g，定容到1000ml，调节pH至7.2，取50ml分装； 步骤二样本标记与检测: 将脑脊液样本1000转/分离心5分钟，弃上清液，加入1.3中稀释液C200 μ 1，重悬，制成待测标本； 步骤三采用流式细胞仪进行检测: 按照流式细胞仪的操作规程，对步骤二中制备的待测标本进行测试，并用Flowjo分析软件进行数据分析， .3.1将重悬的待测标本振荡后进行流式细胞检测，采用二维点图形式进行结果分析:先建立FSC/SSC点图，排除细胞碎片，选取Rl区； .3.2在3.1的样本中加入5 μ I检测液Α，再次上机检测，吸样量为50 μ 1，FL1_A/FL4_A双通道检测； . 3.3在3.2的样本中加入5μ I检测液B，再次上机检测，获得流式细胞数据，用Flowjo分析软件，在PI_Cy5-A/V1Blue-A双参数点图中进行调整。
【专利摘要】本发明涉及医学生物检测技术领域，本发明提供了一种隐球菌活力的检测试剂盒，试剂盒采用两种荧光染料分别标记真菌菌体和真菌活力，利用该试剂盒、并借助普通流式细胞仪的辅助，可快速准确分析脑脊液隐球菌数量和活力，本发明还提供了一种利用上述的隐球菌活力检测试剂盒的检测方法，对患者预后判断和临床治疗方案制定具有重要指导意义。
【IPC分类】G01N15-14
【公开号】CN104677809
【申请号】CN201310627949
【发明人】潘搏, 廖万清, 潘炜华
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2013年11月29日