L_la的表达量与预先测定的集体角质层中的IL-1RA、IL_1 α的表达量分布进行对比的对比工序。受试者的IL-1RA表达量与预先测定的集体角质层中的IL-1RA表达量分布相比，当表达量多时，判定为皮肤的血流量大，当表达量少时，判定为皮肤的血流量小。受试者的IL-1 α表达量与预先测定的集体角质层中的IL-1 α表达量分布相比，当表达量多时，判定为皮肤的血流量小，当表达量少时，判定为皮肤的血流量大。
[0042]以下，关于具体的实施例进行说明，但本发明不限定于下述实施例。
[0043]实施例
[0044]试验例I
[0045]受试集体的皮肤血流量的测定结果与IL-1RA表达量测定结果的分布相关。
[0046]<受试者>
[0047]将75名健康女性脸颊的角质层通过胶带剥离法进行采集。
[0048]<角质层样品提取方法、蛋白质定量>
[0049]在受试者的脸颊贴上角质层测试片(ASAHIB10MED公司制)来采集角质层。从角质层测试片用珠磨法(在容器中加入受试物、直径约2mm的玻璃珠和提取液进行振荡提取的方法)使用 500 μ I 的 T-PER提取缓冲液(Tissue Protein ExtRAct1n Reagent ThermoScientific制(product#78510)来进行角质层蛋白质的提取。各样品的蛋白质量通过Pierce BCA protein Assay Kit (Thermo Scientific#23225)进行测定。测定时，在 10μ1所述角质层蛋白质提取液中加入200 μ I Pierce BCA protein Assay Kit的反应试剂液，在60°C孵育30分钟后，测定562nm处的吸光度。同时，用BSA(牛血清白蛋白)制作标准曲线，从吸光度的值计算蛋白质量。
[0050]<角质层中的IL-1RA的表达量测定>
[0051]同样地将从胶带提取的角质层蛋白质提取液中的IL-1RA表达量使用R&Dsystems 的 ELISA 试剂盒[Human IL-lRA/IL_lF3Quantikine ELISA Kit]进行测定。首先，在costar制的96孔板(#3590)中将成为初次抗体的固相化抗体用试剂盒指定的浓度在20°C过夜进行固相化。接着，用1% BSA在37°C下放置I小时来封闭培养板，并用0.01%Tween-PBS洗净培养板后，将各100 μ I成为标准曲线的标准品及样品进行加样，在25°C孵育2小时。用0.01 % Tween-PBS洗净培养板后，将2次抗体用试剂盒指定浓度在25°C下孵育2小时。进而，用0.01% Tween-PBS洗净培养板后，将Sti^ptavidin-HRP用试剂盒指定浓度在25°C下孵育30分钟。最后，用0.01% Tween-PBS洗净培养板后，按照100 μ I/well加入作为显色基质的TMB solut1n (Promega, G7431)),经过试剂盒指定的时间后,力口Λ 100 μ I终止液(0.5Μ硫酸)，测定450nm处的吸光度来计算IL-1RA的表达量。
[0052]<皮肤血流量的测定>
[0053]使用激光多普勒血流量计(LiscaAb 制 PIMII Laser Doppler Perfus1nImager)测定与受试者脸颊的血流量成比例的相对输出量(V)。
[0054]< 结果 >
[0055]X轴为ILl-RA表达量、Y轴为与血流量成比例的相对输出量(V)将测定结果制成散点图，以该散布数据为基础求出直线回归式。散点图及回归直线、相关系数、相关式如图1所示。
[0056]X轴为ILl-RA值、Y轴为与血流量成比例的相对输出量(V)时，回归式表示Y =0.005110+0.4434、R2 = 0.0703、相关系数 0.27 的直线回归。
[0057]可从图1所示的回归直线或回归式将测定的ILl-RA换算成与血流量成比例的相对输出量(V)。此外，从散点图判明与标准的皮肤血流量成比例的相对输出量(V)的分布。只要基于该散点图及回归式，通过测定皮肤角质层中的IL-1RA的表达量，皮肤的血流量即可知，而且从分布可评价受试者的血流量是否正常。
[0058]试验例2
[0059]与受试集体的皮肤血流量成比例的相对输出量(V)的测定结果和IL-1 α的表达量测定结果的分布相关。
[0060]<受试者>
[0061]将73名健康女性脸颊的角质层通过胶带剥离法进行采集。
[0062]<角质层样品提取方法、蛋白质定量>
[0063]与IL-1RA的测定同样地进行测定。
[0064]<角质层中的IL-1a的测定>
[0065]与试验例I同样地将从胶带提取的角质层蛋白质提取液中的IL-1 α表达量使用R&D systems 的ELISA试剂盒[Human IL-1 a /IL-1FlQuantikine ELISA Kit]进行测定。首先，在costar制的96孔板(#3590)中将成为初次抗体的固相化抗体用试剂盒指定的浓度在20 0C过夜进行固相化。接着，用I % BSA在37 °C下放置I小时来封闭培养板，并用0.0I %Tween-PBS洗净培养板后，将各100 μ I成为标准曲线的标准品及样品进行加样，在25°C孵育2小时。用0.01% Tween-PBS洗净培养板后，将2次抗体用试剂盒指定浓度在25°C下孵育2小时。进而，用0.01% Tween-PBS洗净培养板后，将Str印tavidin-HRP用试剂盒指定浓度在25°C下孵育30分钟。最后，用0.01% Tween-PBS洗净培养板后，按照100 μ I/well加入作为显色基质的TMB solut1n (Promega, G7431),经过试剂盒指定的时间后，加入100 μ I终止液(0.5Μ硫酸)，测定450nm处的吸光度并计算表达量。
[0066]<皮肤血流量的测定>
[0067]与试验例I同样，使用激光多普勒血流量计(Lisca Ab制PMII Laser DopplerPerfus1n Imager)测定与受试者脸颊的血流量成比例的相对输出量(V)。
[0068]< 结果 >
[0069]X轴为IL-1 α表达量、Y轴为血流量将测定结果制成散点图，以该散布数据为基础求出直线回归式。散点图及回归直线、相关系数、相关式如图2所示。
[0070]X轴为IL-1a值、Y轴为与血流量成比例的相对输出量(V)时，回归式表示Y =—
0.1873Χ+0.5681、R2 = 0.0912、相关系数0.30的负的直线回归。
[0071]可从图1所示的回归直线或回归式将测定的IL-1 α换算成血流量。此外，从散点图判明了标准的皮肤血流量的分布。只要基于该散点图及回归式，通过测定皮肤角质层中的IL-1a的表达量，皮肤的血流量即可知，而且从分布可评价受试者的血流量是否正常。
【主权项】
1.一种皮肤血流量的间接测定或评价方法，其特征在于，以皮肤角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1 α的表达量作为指标。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于测定或评价方法的皮肤角质层通过胶带剥离法进行采集。
3.一种方法，其特征在于，从基于预先测定的血流量与皮肤角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1 α的表达量的相关性制作的相关式来间接测定皮肤的血流量。
4.一种皮肤血流量的间接测定法，其特征在于，由以下工序构成: 采集角质层的采集工序、 测定所述采集工序中所采集的角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1a的表达量的测定工序，和 将所述测定工序中所测定的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1 a的表达量通过下述回归式换算成皮肤血流量的工序，所述回归式为从预先测定的集体角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1 a的表达量分布求出的得到血流量相关的回归式。
5.一种皮肤血流量的评价方法，其特征在于，与基于预先测定的血流量与皮肤角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1 a的表达量的相关性制作的散点图进行对比来评价。
6.一种皮肤血流的评价方法，其特征在于，由以下工序构成: 采集角质层的采集工序、 测定所述采集工序中所采集的角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1 a的表达量的测定工序，和 将所述测定工序中所测定的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1 a的表达量与预先测定的集体角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1 a的表达量分布进行对比的对比工序。
【专利摘要】本发明的课题在于提供不是外科摘取皮肤而对皮肤带来刺激等的方法，而是可简便且确实地测定或评价血流状态的使用生物化学指标的新颖的测定或评价方法。一种皮肤血流量的间接测定或评价方法，其特征在于，以皮肤角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1α的表达量作为指标。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104777306
【申请号】CN201410563850
【发明人】榎本有希子, 池田麻里子
【申请人】株式会社芳珂
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2014年10月21日