一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测s100的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种化学发光免疫学检测S10的方法。
【背景技术】
[0002]目前市场上对SlOO蛋白的免疫学检测方法主要包括酶联免疫分析法、电化学发光法、放射免疫分析法、免疫放射测定法和荧光免疫测定法等。酶联免疫分析法可用于定量检测，但操作步骤繁琐，受人为因素影响大，在灵敏度、特异性和应用范围上差别很大。电化学发光法定量检测的准确度较高，水平具有定量和稳定的优点，但是不适合于现代自动免疫仪器，需要专门的配套仪器使用，投资成本较高、因此难以推广应用。放射免疫分析法和免疫放射测定法存在放射污染和危害，核素半衰期短，试剂盒稳定期短，操作繁琐等不足而应用受限。荧光免疫测定法需专门的荧光设备，因此临床上不易普及。
[0003]传统的磁性微粒大多是通过表面功能化修饰后带有的羧基(-COOH)、羟基(-OH)、氨基(-NH2)、醛基(-CHO)等活性基团与抗原或抗体的共价作用将这些抗原抗体偶联在磁珠表面的。偶联过程复杂，而且在偶联时容易导致抗原或抗体失活，不仅偶联效率低，而且浪费成本，由于这些原因，使得基于磁性微粒的化学发光的普及应用受到一定的限制。
[0004]磁性复合微粒，又称磁性微球或磁珠，是20世纪70年代末发展起来并被广泛用于生物医学领域的超顺磁性纳微米复合粒子，是由高分子或无机材料与磁性超细粉末(包括磁性金属如Fe，Co，Ni或其金属氧化物等)构成的胶态复合物。在外加磁场作用下，磁性粒子的超顺磁性可保证既能被快速分离，本身又不会被永久磁化。纳微米级磁性复合微粒具有较高的比表面积，表现出较强的吸附能力。通过物理吸附，或利用修饰在磁性复合微粒表面的活性基团可将酶、抗体、寡核昔酸及核酸等生物活性物质偶联在其表面。因而磁性抗体免疫技术(Magnetic Antibody Immunoassay, ΜΑΙΑ)技术具检测速度快、特异性高、灵敏度高、重复性好、无放射性污染等优点，该方法在医学检测、环境监测及食品安全检测等领域有着很好的应用前景。
[0005]胶体金很早就被用于生物分子的标记和检测，将磁性纳米粒子在外磁场中的可分离性和胶体金特性结合起来，制备组成为Fe/Au，Fe3O4Au, Co/Au等磁性微粒被称为“金磁微粒”。
[0006]金磁微粒是一种新型磁性无机物复合微粒，由胶体金颗粒与磁性粒子复合形成的，这种材料兼有磁性粒子在外磁场中的可分离性以及胶体金对生物分子的快速固定化等特点，在生物与医学领域具有重要的应用前景。结合磁性纳米粒子的超顺磁性和金表面生物分子可修饰性的双重特质，发明人研制了 Fe3O4Au磁性复合微粒，并将其实现了商业化。
[0007]化学发光免疫分析技术诞生于1977年。Halmann等根据放射免疫分析的基本原理，将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，建立了化学发光免疫分析法。该技术包含两个系统，即免疫分析系统和化学发光分析系统。因此，它兼具免疫分析高特异性及化学发光高灵敏度于一体的特点。免疫分析系统是应用抗原、抗体间反应的原理，通过将化学发光物或酶标记于抗原或抗体上，经过免疫反应，形成抗原-抗体复合物。化学发光分析系统则是在免疫反应结束后，加入酶的化学发光底物或氧化剂，化学发光物质在氧化剂作用下形成激发态的中间体，不稳定的中间体在回到稳定基态时，将发射出光子，此时可通过化学发光检测器对化学发光强度进行检测。该方法能够进行定性分析和定量分析，是一种综合性技术。
[0008]基于磁性微粒的化学发光免疫分析法是将磁分离技术、免疫分析技术及化学发光检测技术三者有效结合在一起的新型的分析检测技术，因而具有化学发光的高灵敏度、免疫分析的强特异性、磁分离系统的快速分离的特点，此外，还具有检测时间短、线性范围宽、以及易实现自动化等优点，因此，近年来被广泛应用于临床诊断、生物医学、食品安全及毒品检测等众多方面。
[0009]在实际检测过程中，针对不同的检测因子，因其检测范围、灵敏度需求不同，免疫反应、磁分离、化学发光各系统的条件优化和相互协调就显得非常重要。尤其是新型创新磁性颗粒偶联抗原或抗体的方式、免疫反应的抗体用量及反应时间、磁分时长及次数、化学发光剂及底物选择，都是此方法研宄的重点和难点。
【发明内容】
[0010]本发明提供了一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测SlOO的方法，以解决上述【背景技术】检测S10存在的局限性、特异性、灵敏性、危险性等问题。
[0011]为实现上述发明目的，本发明给出以下基本解决方案:
[0012]一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测SlOO的方法，包括以下步骤:
[0013]⑴包被
[0014]以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将SlOO抗体偶联在金磁微粒的表面；
[0015](2)封闭
[0016]用封闭液封闭金磁微粒表面未与抗体结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用；
[0017](3)与待测物结合
[0018]将待检样品和能与抗原发生特异性结合的酶标二抗加入经过步骤(2)封闭后的结合有SlOO抗体的金磁微粒中反应，待测样品中游离的SlOO蛋白被磁微粒上包被的特异抗体捕获，同时与酶标二抗结合，形成“双抗体夹心复合物”;
[0019]⑷清洗
[0020]用清洗缓冲液清洗双抗体夹心复合物，磁性分离，弃上清；
[0021](5)检测
[0022]向经过步骤(4)处理后形成的双抗体夹心复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后的25?35min内测量各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成反比关系。
[0023]为实现更好的检测效果，步骤(I)具体可以包括以下步骤:
[0024](1.1)预处理:取金磁微粒，用平衡缓冲液平衡I?3遍；
[0025](1.2)偶联:将SlOO抗体与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在35-38°C，170?210rpm条件下充分反应30?40min，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；
[0026](1.3)清洗:用清洗缓冲液清洗3-4次，磁性分离，弃上清；
[0027](2)封闭
[0028]在步骤⑴的产物中加入封闭液，置于摇床中，在35_38°C条件下，以170?21Orpm的转速反应1.3?1.7小时，封闭金磁微粒表面未与SlOO抗体结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用。
[0029](3)与待测物结合
[0030]将待检样品和能与抗原发生特异性结合的酶标二抗加入经过步骤(2)封闭后的结合SlOO抗体的金磁微粒中反应，待测样品中游离的SlOO蛋白被磁微粒上包被的特异抗体捕获，同时与酶标二抗结合，形成“双抗体夹心复合物”;
[0031](4)清洗
[0032]用清洗缓冲液清洗双抗体夹心复合物，磁性分离，弃上清；
[0033](5)检测
[0034]向经过步骤(4)处理后形成的双抗体夹心复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后的25?35min内测量各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成反比关系。
[0035]步骤(1.1)平衡缓冲液选自以下缓冲液中的任一种:
[0036]ρΗ6.5?7.8，浓度为0.0lM?0.05Μ的磷酸盐(PB)缓冲液、
[0037]ρΗ7.2?7.8，浓度为0.0lM?0.05Μ的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、
[0038]ρΗ7.4 ?8.2，浓度为 0.0lM ?0.04Μ 的 BS 缓冲液；
[0039]步骤(1.2)偶联缓冲液选自以下缓冲液中的任一种:
[0040]ρΗ3.6?5.8，浓度为0.0lM?(λ 02Μ的醋酸盐缓冲液、
[0041]ρΗ6.5?7.8，浓度为0.0lM?0.05Μ的磷酸盐(PB)缓冲液、
[0042]ρΗ7.2?7.8，浓度为0.0lM?0.04Μ的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；
[0043]步骤(1.3)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.04-0.07%吐温的该种缓冲液:
[0044]ρΗ3.6?5.8，浓度为0.0lM?0.02Μ的醋酸盐缓冲液、
[0045]ρΗ6.5?7.8