.8，含0.1%吐温-20的0.0lM PB缓冲液清洗3次，磁粒悬于Iml pH7.8的0.02M Tris-HCl的保存缓冲液中，4°C备用。
[0095](3)与待测物结合:取出包被后的金磁微粒，于室温下平衡20min，依次加入包被有 SlOO 抗体的金磁微粒 20 μ 1、待测样本(0ng/ml、0.05ng/ml、0.lng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、lng/ml、3ng/ml、6ng/ml、12ng/ml、35ng/ml)各 50 μ 1、ALP 标记羊抗鼠 50 μ 1，置摇床中35°C，190rpm，反应2.2h，形成双抗体夹心复合物。
[0096](4)清洗:取出离心管置于磁性分离器上，弃上清，用pH 8.2含0.05%吐温-20的0.02M Tris-HCl清洗缓冲液清洗3次，磁性分离2min，弃上清。
[0097](5)检测:将经过步骤(4)处理后形成的双抗体夹心复合物的金磁微粒转入96孔板，并向其加入发光底物AMPro溶液100 μ 1，于加入后的35min内检测各孔的发光强度(RLU)，其发光强度与待测样本浓度关系如图四所示，在0.05ng/ml?35ng/ml范围内线性较好，最低检出限可达0.02ng/mlo
[0098]结论:图4是基于金磁的化学发光检测SlOO的剂量反应曲线，在0.05ng/ml?35ng/ml线性良好，最低检测限达0.02ng/ml。
[0099]图5是基于金磁的化学发光检测SlOO的剂量反应曲线，在0.05ng/ml?35ng/ml线性良好，最低检测限达0.02ng/mlo
【主权项】
1.一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测SlOO的方法，包括以下步骤: (1)包被 以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将SlOO抗体偶联在金磁微粒的表面；具体过程如下: (1.1)预处理:取金磁微粒，用平衡缓冲液平衡I?3遍； (1.2)偶联:将SlOO抗体与偶联缓冲液混合，将所得混合液加入经过预处理的金磁微粒中，置于摇床，在35-38°C，170?210rpm条件下充分反应30?40min，反应完后，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清； (1.3)清洗:用清洗缓冲液清洗3-4次，磁性分离，弃上清； (2)封闭 在步骤(I)的产物中加入封闭液，置于摇床中，在35-38°C条件下，以170?210rpm的转速反应1.3?1.7小时，封闭金磁微粒表面未与SlOO抗体结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗后悬于保存缓冲液中保存备用； (3)与待测物结合 将待检样品和能与抗原发生特异性结合的酶标二抗加入经过步骤(2)封闭后的结合SlOO抗体的金磁微粒中反应，待测样品中游离的SlOO蛋白被磁微粒上包被的特异抗体捕获，同时与酶标二抗结合，形成“双抗体夹心复合物”; (4)清洗 用清洗缓冲液清洗双抗体夹心复合物，磁性分离，弃上清； (5)检测 向经过步骤(4)处理后形成的双抗体夹心复合物中加入化学发光底物液，在化学发光底物液加入后的25?35min内测量各孔的发光强度；发光强度与待测样本的浓度成反比关系O
2.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的化学发光免疫学检测SlOO的方法，其特征在于: 步骤(1.1)平衡缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ6.5?7.8，浓度为0.0lM?0.05Μ的磷酸盐(PB)缓冲液、 ρΗ7.2?7.7，浓度为0.0lM?0.05Μ的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液、 ρΗ7.4?8.2，浓度为0.0lM- 0.04Μ的BS缓冲液； 步骤(1.2)偶联缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ3.6?5.8，浓度为0.0lM- 0.02Μ的醋酸盐缓冲液、 ρΗ6.5?7.8，浓度为0.0lM?0.05Μ的磷酸盐(PB)缓冲液、 ρΗ7.2?7.7，浓度为0.0lM- 0.04Μ的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；步骤(1.3)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.04-0.07%吐温的该种缓冲液: ρΗ3.6?5.8，浓度为0.0lM- 0.02Μ的醋酸盐缓冲液、 ρΗ6.5?7.8，浓度为0.0lM?0.05Μ的磷酸盐(PB)缓冲液、 ρΗ7.2?7.7，浓度为0.0lM- 0.04Μ的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液； 步骤(2)所述封闭液为牛血清白蛋白、脱脂奶粉、赖氨酸或动物血清之中的任一种或其中2-3种的混合物，该封闭液的质量体积浓度(g/ml)为2-5% ;所述动物血清为胎牛血清或马血清，封闭剂配置缓冲溶液为偶联缓冲液； 所述封闭剂配置缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ7.7?8.0，浓度为0.0lM- 0.04Μ的磷酸盐(PB)缓冲液、 ρΗ7.6?8.2，浓度为0.0lM- 0.05Μ的BS缓冲液、 ρΗ7.9?8.3，浓度为0.0lM- 0.05Μ的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；步骤(2)中采用的清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或含0.08-0.15%吐温的该种缓冲液: ρΗ7.7?8.0，浓度为0.005Μ?0.02Μ的磷酸盐(PB)缓冲液、 ρΗ7.6?8.2，浓度为0.0lM- 0.05Μ的BS缓冲液、 ΡΗ7.9?8.3，浓度为0.0lM?0.04Μ的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液； 步骤⑵中采用的保存缓冲液选自以下缓冲液中的任一种: ρΗ7.7?8.0，浓度为0.0lM?0.05Μ的磷酸盐(PB)缓冲液、 ρΗ7.6?8.2，浓度为0.0lM- 0.05Μ的BS缓冲液、 ΡΗ7.9?8.3，浓度为0.0lM?0.04Μ的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液；步骤(4)所述清洗缓冲液选自以下缓冲液中的任一种或者含0.02-0.1%吐温的该种缓冲液: ρΗ7.7?8.0，浓度为0.0lM?0.05Μ的磷酸盐(PB)缓冲液、 ρΗ7.6?8.2，浓度为0.0lM- 0.05Μ的BS缓冲液、 ρΗ7.9?8.2，浓度为0.0lM?0.04Μ的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液。
3.根据权利要求2所述的基于金磁微粒的化学发光免疫学检测SlOO的方法，其特征在于: 所述步骤(1.3)中的清洗缓冲液是含0.05%吐温的该种缓冲液； 所述步骤(2)中的清洗缓冲液是含0.1 %吐温的该种缓冲液； 所述步骤(4)中的清洗缓冲液是含0.05%吐温的该种缓冲液。
4.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的化学发光免疫学检测SlOO的方法，其特征在于: 步骤(I)中采用的SlOO单克隆抗体为Meridian或Hytest公司产品。
5.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的化学发光免疫学检测SlOO的方法，其特征在于: 步骤(3)反应的条件为:将待检样品和酶标二抗加入金磁微粒中，置于摇床，在35-38°C条件下，以170?210rpm的转速反应1.8?2.2小时；采用的酶标二抗是碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠或山羊抗兔。
6.根据权利要求1所述的基于金磁微粒的化学发光免疫学检测SlOO的方法，其特征在于:步骤(5)中采用的化学发光底物是鲁米诺、异鲁米诺或1，2 一二氧乙烷类衍生物。
7.根据权利要求6所述的基于金磁微粒的化学发光免疫学检测SlOO的方法，其特征在于:所述1，2 一二氧乙烷类衍生物是AMPPD、CSPD或CDP-STAR。
【专利摘要】本发明提供了一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测S100的方法，主要包括以下步骤：(1)包被，即以金磁微粒作为免疫反应和固相分离的载体，将S100抗体偶联在金磁微粒的表面；(2)封闭，即用封闭液封闭金磁微粒表面未与S100抗体结合的空白位点；然后磁性分离，弃上清；(3)将待检样品和能与抗原发生特异性结合的酶标二抗加入经过步骤(2)封闭后的结合S100抗体的金磁微粒中反应，形成“双抗体夹心复合物”；(4)清洗；(5)检测。本发明的方法检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好、无放射性污染、操作安全、方法简便快速。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104777315
【申请号】CN201510184976
【发明人】马乐, 张小梅, 吴松迪, 崔亚丽
【申请人】西安金磁纳米生物技术有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月17日...