LB/c小鼠进行免疫；
2)抗原配置:用高碘酸钠法(Na14)将光滑型的鼠伤寒沙门氏菌LPS(购于Sigma公司)与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联，获得LPS- BSA人工抗原；具体操作方法如下:取光滑型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖LPS 1mg用超纯水溶解，按照反应摩尔比Na14: LPS=9:1滴加不同体积的200mM/L Na14溶液到光滑型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖LPS溶液中，25°C反应2h ;然后取1yL 1M/L的乙二醇溶液到反应液中，25°C反应2h。按照反应摩尔比LPS: BSA=5: I的比例将活化后的光滑型鼠伤寒沙门氏菌脂多糖LPS反应液滴加到BSA溶液中，用0.01M、PH9.6的碳酸盐缓冲液(CB)调节反应液pH至偏碱性。室温反应过夜，即得沙门氏菌交叉型抗体的免疫原；
将LPS-BSA人工抗原作为免疫原用生理盐水稀释，配成2mg/mL的溶液；
3)乳化:将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法进行乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠；
4)免疫:按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合；
5)采血:第三次免疫后I周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价；
6)融合、筛选:采用杂交瘤技术进行融合，采用间接Elisa筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆；
7)抗体的纯化和保存:采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20°C保存。
[0021]2、ELISA 反应过程:
抗体效价测定步骤:
1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100^17孔，于371温育箱内温育2 ho取出酶标板后将板甩干，每孔注入200 μ L PBST溶液，摇床上振荡3 min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同；
2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200yL/孔，于37°C温育箱内温育2 h后取出烘干待用；
3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100μ L/孔，37 °C孵育I h后洗涤、拍干；
4)每孔加入100^，1:3000稀释的!《^标记的羊抗鼠186，371孵育111后洗涤、拍干； 5)每孔加入100 μ L显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37°C反应15 min，取出后每孔加入100 μ L终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A45tl;
沙门氏菌属特异性双抗体夹心法测定步骤:
a、包被:用4μ g/mL的8G3包被酶标板，100 μ L /孔，37°C温育箱内温育2 h ；
b、洗涤:用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μ L/孔，然后甩干反应板；
C、封闭:含0.2%明胶的CBS, 200 μ L /孔，37°C封闭2h ；
d、洗涤:同b;
e、样品:用PBST 将沙门氏菌稀释成 1*10~8、5*10~7、2.5*10~7、1.25 *10~7、6.25*10~6、3.13 *10~6、1.6 *10~6 CFU/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照。每孔加入10(^1^样品，于37°〇温育Ih ；
f、洗涤:同b;
g、加检测抗体(8G3-HRP，2μ g/mL)，100 μ L / 孔，37°C反应 Ih ；
h、洗涤:同b;
1、显色:加底物TMB100 μ L /孔，显色1min ； j、终止:加终止液50 μ L /孔；
k、测定:用酶标仪检测0D45(lnm。
[0022]交叉率的测定
将甲型副伤寒沙门氏菌(A群)、鼠伤寒沙门氏菌(B群)、阿贡那沙门氏菌(B群)、乙型副伤寒沙门氏菌(B群)、汤普逊沙门氏菌(Cl群)、布洛克利沙门氏菌(C2群)、肯塔基沙门氏菌(C3群)、肠炎沙门氏菌(D群)、都柏林沙门氏菌(D群)、伤寒沙门氏菌(D群)、鸭沙门氏菌(E 群)、亚利桑那沙门氏菌(Arizona 亚属)稀释成 1*10~8、5*10~7、2.5*10~7、1.25 *10~7、6.25*10~6、3.13 *10~6、1.6 *10~6 CFU/mL 系列浓度并检测。将 E.col1、E.coli 0157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌稀释到10~8 CFU/mL在建立的沙门氏菌双抗体夹心法体系中检测吸光值，并设空白孔，每个浓度做6次测定平均值，做3次重复实验。
[0023]试验结果如下:
1、标准曲线:本发明所获得的抗原检测的检测范围是为10~6?10~8 CFU/mL,R2=0.98,具体请见说明书附图。
[0024]2、LOD:L0D是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的标准偏差对应的抗原浓度，沙门氏菌双抗体夹心法对甲型副伤寒沙门氏菌的LOD为10~6 CFU/mL。
[0025]3、交叉反应
结果:沙门氏菌菌属的均显色，对甲型副伤寒沙门氏菌(A群)、鼠伤寒沙门氏菌(B群)、阿贡那沙门氏菌(B群)、乙型副伤寒沙门氏菌(B群)、汤普逊沙门氏菌(Cl群)、布洛克利沙门氏菌(C2群)、肯塔基沙门氏菌(C3群)、肠炎沙门氏菌(D群)、都柏林沙门氏菌(D群)、伤寒沙门氏菌(D群)、鸭沙门氏菌(E群)、亚利桑那沙门氏菌(Arizona亚属)。而10~8 CFU/mL浓度的其它测试菌株E.coli, E.coli 0157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌均不显色(0D〈 0.15)。说明建立的沙门氏菌夹心ELISA方法具有沙门氏菌属特异性，与E.coli, E.coli 0157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，特异性良好。
【主权项】
1.一种基于单克隆抗体的检测食品中沙门氏菌属的特异性双抗体夹心法，其特征在于酶标板上包被了包被抗体8G3，可特异性捕获沙门氏菌属内的沙门氏菌，包被抗体8G3与沙门氏菌结合后催化底物在450nm产生吸收值，P/N彡2.1时被判定为阳性，反之，P/N < 2.1则判定为阴性； 抗体8G3，即细胞株O，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号:CGMCC N0.9804 ； 步骤为: (1)沙门氏菌属交叉型LPS单克隆抗体细胞株的制备 用合成的沙门氏菌LPS-BSA人工抗原为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合，筛选采用不同血清群的沙门氏菌和Ra LPS测试细胞株的交叉反应并挑选具有较强交叉反应的细胞进行亚克隆，最终得到了 12株交叉型的沙门氏菌属特异性单克隆抗体； (2)单克隆抗体的配对筛选 12株沙门氏菌属特异性单克隆抗体纯化后分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下:包被抗体8G3 4 μ g/mL ;包被液为pH9.6、0.0lM的碳酸盐缓冲液；标品浓度5X 10~7CFU/mL ;标品稀释液pH7.2,0.0lM的PBS ;检测抗体8G3-HRP稀释1000倍使用，在此条件下，实验成功得到了 10对P/N>5的配对； (3)沙门氏菌属特异性ELISA方法的建立 选择检测限稳定、灵敏的配对，用包被抗体8G3和检测抗体8G3-HRP建立了沙门氏菌属特异性的夹心ELISA分析方法；具体参数如下: 包被抗体8G3包被浓度:4 μ g/mL, 包被液:pH9.6,0.0lM碳酸盐缓冲液， 标品稀释液:含3.3mM EDTA的ρΗ7.2、0.0lM的Tris-HCl溶液， 检测抗体浓度:2 μ g/mL， 反应时间:包被、封闭:37°C，2h ;标准品:37°C，Ih ;检测抗体37°C, Ih ;显色1min ； 该ELISA对沙门氏菌属内的甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、汤普逊沙门氏菌、布洛克利沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌均有交叉反应，对应的检测限 P/N 彡 2.1，分别为:1.5X10~6CFU/mL、l.5X 10~6CFU/mL、6.3X 10~6CFU/mL、1.3X10~7CFU/mL、3.1 X 10~6CFU/mL、3.1 X 10~6CFU/mL、6.3 X 10~6CFU/mL、6.3X10~6CFU/mL、2.5X10~7CFU/mL、2.5X 10~7CFU/mL、6.3X 10~6CFU/mL、2.5X10~7CFU/mL ；与 E.col1、E.coli 0157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应。
【专利摘要】一种基于单克隆抗体的检测食品中沙门氏菌属的特异性双抗体夹心法，属于免疫分析领域。本发明用高碘酸钠法将光滑型鼠伤寒沙门氏菌LPS偶联牛血清白蛋白免疫7周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合、筛选得12株特异性识别沙门氏菌属的LPS单克隆抗体。12株抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP并以甲型副伤寒沙门氏菌菌体进行两两配对。以8G3作为包被抗体，8G3-HRP作为检测抗体，建立检测沙门氏菌属特异性双抗体夹心法，检测甲型副伤寒沙门氏菌LOD为10^6CFU/mL。本方法与沙门氏菌属内的菌均有交叉反应，而与E.coli、E.coli O157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，为食品中沙门氏菌属的检测提供了全面、可靠、快速高效的分析手段。CGMCC No.980420141015
【IPC分类】G01N33-577
【公开号】CN104792991
【申请号】CN201510183851
【发明人】匡华, 胥传来, 王文彬, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 胡拥明
【申请人】江南大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月17日