的广金钱草药材，加入75%乙醇于25ml量瓶中，超声 20min，放冷，定容，即得；
[0182] 广金钱草总黄酮提取物：精密称取25mg的样品，置100mL量瓶中，加入75%乙醇 至近刻度线，超声20min，放冷，定容即可。
[0183] 得到的色谱图如图29所示，其中图29-1是141201批次总黄酮提取物与其原药材 对应图谱，图29-2是141202批次总黄酮提取物与其原药材对应图谱，图29-3是141203批 次总黄酮提取物与其原药材对应图谱，图29-4是141204批次总黄酮提取物与其原药材对 应图谱，图29-5是141205批次总黄酮提取物与其原药材对应图谱，图29-6是150101批次 总黄酮提取物与其原药材对应图谱，图29-7是150102批次总黄酮提取物与其原药材对应 图谱，图29-8是150103批次总黄酮提取物与其原药材对应图谱，图29-9是150104批次总 黄酮提取物与其原药材对应图谱，图29-10是140504批次总黄酮提取物与其原药材对应图 谱。
[0184] 图29色谱图结果显示，总黄酮提取物在经过药材提取后，物质基础没有发生变 化，从而保证了总黄酮提取物临床效果。
[0185] 实施例6测定广金钱草总黄酮提取物样品的液相色谱图
[0186] 在上述色谱条件下，分别称取十个批次的广金钱草总黄酮提取物的样品进行测 定，注入液相色谱仪，得到十个批次的色谱图，色谱图如图30所示，峰的相对保留时间如表 12所示，经比较十个批次的广金钱草总黄酮提取物均有此12个特征峰，且相对保留时间稳 定。
[0187] 表 12
[0188]
[0189] 实施例7建立广金钱草黄酮提取物的特征图谱
[0190] 色谱条件：以十八烷基键合硅胶Waters ACQUITY BEH C18 (2. ImmXlOOmm, L 7微 米）为填充剂，以甲醇为流动相A，以0. 1%的甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱条件如表3所 示；柱温为25°C ;检测波长为272nm。理论塔板数按夏佛塔苷计算应不低于5000。
[0191] 配制参照物溶液取夏佛塔苷对照品适量，精密称定，加75%乙醇制成每1ml含夏 佛塔苷20ug的溶液，即得。
[0192] 配制检测样品溶液称取广金钱草总黄酮提取物约25mg，加入75%乙醇置50ml量 瓶至近刻度线，超声20min，放冷，定容即可。
[0193] 测定特征图谱分别精密吸取参照物溶液和检测样品溶液各lul，注入超高效液相 色谱仪，即得。
[0194] 检测样品图谱中应有12个特征峰，与参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰 与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内。规定值为0. 628(峰 1)、0· 656 (峰 2)、0· 757 (峰 3)、0· 831 (峰 4)、0· 957 (峰 5)、0· 972 (峰 6)、1. 000 (峰 S)、 1. 138 (峰 8)、1. 240 (峰 9)、1. 308 (峰 10)、1. 333 (峰 11)、1. 385 (峰 12)。广金钱草总黄酮 提取物对照特征图谱如图31所示，其中峰1是Vicenin-2,峰3是木犀草素 -6-C- a -L-吡 喃阿拉伯糖-8-C- β -D-吡喃葡萄糖苷，峰4是Vicenin-I，峰6是木犀草素 -6-C- β -D-吡 喃葡萄糖-S-C-β -吡喃木糖苷，峰7是夏佛塔苷，峰8是染料木素 -7-0-β -D-呋喃芹 糖基-(1 - 6)-0-β -D-吡喃葡萄糖苷，峰10是新夏佛塔苷，峰11是异牡荆苷，峰12是 Vicenin-3〇
[0195] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0196] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法，其特征在于，包括： 将广金钱草样品与乙醇混合，并通过回流或超声方法进行提取，以便获得总黄酮提取 物， 其中，所述乙醇的浓度为25~95%，所述广金钱草的重量与所述乙醇的体积比为 25mg:25 ~100ml，优选 25mg:50ml。2. 根据权利要求1所述的从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法，其特征在于，采用 超声方法进行提取10~40分钟，优选20分钟。3. 根据权利要求1所述的从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法，其特征在于，所述 乙醇的浓度为75%。4. 一种建立广金钱草总黄酮提取物特征图谱的方法，其特征在于，包括： 按照权利要求1~3任一项所述的方法，从广金钱草中提取总黄酮提取物； 对所述总黄酮提取物进行液相色谱分析，并基于所得到的液相色谱分析结果建立所述 广金钱草总黄酮提取物特征图谱， 任选地，所述液相色谱分析采用下列条件： 采用甲醇-0. 1 %甲酸体系进行梯度洗脱， 色谱柱为WatersBEHC18 (2.ImmX100mm, 1. 8 微米）， 柱温为25摄氏度， 流速为 〇. 2ml/min; 进样量：1微升， 检测波长为272nm， 洗脱条件：〇5. -种确定广金钱草中黄酮类物质组成的方法，其特征在于，包括： 按照权利要求1~3任一项所述的方法，从广金钱草中提取总黄酮提取物； 对所述总黄酮提取物进行液相色谱分析，并基于所得到的液相色谱分析结果确定所述 广金钱草中黄酮类物质的组成， 任选地，所述液相色谱分析采用下列条件： 采用甲醇-0. 1 %甲酸体系进行梯度洗脱， 色谱柱为WatersBEHC18 (2.ImmX100mm, 1. 8 微米）， 柱温为25摄氏度， 流速为 〇. 2ml/min; 进样量：1微升， 检测波长为272nm， 洗脱条件：〇6. -种确定广金钱草来源的方法，其特征在于，包括： 按照权利要求1~3任一项所述的方法，从广金钱草中提取总黄酮提取物；以及 对所述总黄酮提取物进行液相色谱分析，并基于所得到的液相色谱分析结果确定所述 广金钱草的来源。7. 根据权利要求6所述的确定广金钱草来源的方法，其特征在于，所述液相色谱分析 采用的检测波长为272nm， 任选地，所述液相色谱分析采用下列条件： 采用甲醇-0. 1 %甲酸体系进行梯度洗脱， 色谱柱为WatersBEHC18 (2.ImmX100mm, 1. 8 微米）， 柱温为25摄氏度， 流速为 〇. 2ml/min， 进样量：1微升， 洗脱条件：〇8. 根据权利要求6所述的确定广金钱草来源的方法，其特征在于，基于所得到的液相 色谱分析结果确定所述广金钱草的来源包括： (a) 将所述液相色谱分析结果的色谱图与预定的对照图谱进行比对；以及 (b) 判断所述色谱图与所述对照图谱的相似性，并且基于所述相似性确定所述广金钱 草的来源。9. 根据权利要求8所述的确定广金钱草来源的方法，其特征在于，在步骤（b)中， 所述相似性是基于图谱中下列至少之一位置是否存在峰而确定的：15. 01min、15. 71min、 16.60min、18.04min、19.77min、21. 38min、22. 78min、23. 18min、23. 73min、27. 2min、 29. 51min、31. 08min、31. 72min、32. 98min， 其中，所述位置的峰代表如下：15.Olmin代表vicenin-2,18. 04min代表木犀草 素-6-C-a-L-吡喃阿拉伯糖-8-C- 0 -D-吡喃葡萄糖苷，19. 77min代表vicenin-1， 23. 18min代表木犀草素-6-C- -D-吡喃葡萄糖-8-C- -吡喃木糖苷，23. 73min代表夏佛 塔苷，27. 20min代表染料木素-7-0-0 -D-呋喃芹糖基-(1 - 6)-0-0 -D-吡喃葡萄糖苷， 31. 08min代表新夏佛塔苷，31. 72min代表异牡荆苷，32. 98min代表Vicenin-3。10. 根据权利要求8所述的确定广金钱草来源的方法，其特征在于，在步骤（b)中， 所述相似性是基于图谱中下列位置是否存在峰而确定的：15.Olmin、15. 71min、18. 04min、 19.77min、22.78min、23. 18min、23. 73min、27. 2min、29. 51min、31. 08min、31. 72min、 32.98min， 其中，所述位置的峰代表如下：15.Olmin代表vicenin-2,18. 04min代表木犀草 素-6-C-a-L-吡喃阿拉伯糖-8-C- -D-吡喃葡萄糖苷，19. 77min代表vicenin-1， 23. 18min代表木犀草素-6-C- -D-吡喃葡萄糖-8-C- -吡喃木糖苷，23. 73min代表夏佛 塔苷，27. 20min代表染料木素-7-0-0 -D-呋喃芹糖基-(1 - 6)-0-0 -D-吡喃葡萄糖苷， 31. 08min代表新夏佛塔苷，31. 72min代表异牡荆苷，32. 98min代表Vicenin-3。
【专利摘要】本发明公开了一种从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法，一种建立广金钱草总黄酮提取物特征图谱的方法、一种确定广金钱草中黄酮类物质组成的方法和一种确定广金钱草来源的方法。通过本发明的从广金钱草中提取总黄酮的方法，广金钱草中的总黄酮能够被高效提取，以及总黄酮液相色谱峰的分离度好。本发明提出的建立广金钱草总黄酮提取物特征图谱的方法、确定广金钱草中黄酮类物质组成的方法和确定广金钱草来源的方法具有稳定性和可重复性的特点。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN105092744
【申请号】CN201510551814
【发明人】王学海, 李莉娥, 许勇, 杨仲文, 冯芸, 黄天赐, 黄璐, 杨婷, 杨成兵, 余艳平
【申请人】武汉光谷人福生物医药有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月31日