和交联度的水凝胶，以达到高灵敏度检测。
【附图说明】
[0055] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0056] 图1为图1是本发明智能响应水凝胶荧光适配体传感器快速检测禽流感病毒H5N1 的原理示意图。
[0057] 图2是本发明智能响应水凝胶荧光适配体传感器对浓度范围2 4到2 6凝集单位 (HAU)的禽流感病毒检测结果图，其中（a)为量子点最大发射波长626nm时各浓度样本和对 照样本所对应的荧光发射光谱图，（b)为各荧光强度对各浓度的线性回归曲线；(a)中从上 至下依次为样本2 6、24、22、2°、2 2、2 4、0以及溶剂TBE所对应的荧光图谱；图中均值和误差棒 (标准误差）均是基于三次重复实验的结果。
[0058] 图3是本发明（a)三种不同孔径的智能响应水凝胶荧光适配体传感器对不同浓度 的禽流感病毒（2°、2 2、24和26HAU)检测的结果图，以及（b)两种基于水凝胶尺寸依赖特性的 检测机理的探讨。对于水凝胶A和B遵循的检测机理如（b)左图所示，对于水凝胶C遵循 的检测机理如（b)右图所示；图中均值和误差棒（标准误差）均是基于三次重复实验的结 果。
[0059] 图4是本发明（a)采用两种不同直径的磁珠分别模拟病毒颗粒和荧光信号报告分 子耦合物自然渗透并下沉穿过功能化水凝胶的过程，以及（b)采用一种与荧光信号报告分 子耦合物尺寸相当的磁珠分别在有和无病毒颗粒存在时，在水凝胶中的自然渗透并下沉扩 散的情况。
[0060] 图5是本发明三种不同孔径的智能响应水凝胶的透射电镜SEM观察图。
[0061] 图 5 中，
[0062] 水凝胶A对应的3张图，从左至右标尺刻度依次为：10μπι、4μπι、500ηπι;
[0063] 水凝胶Β对应的2张图，从左至右标尺刻度依次为：5 μ m、1 μ m ;
[0064] 水凝胶C对应的4张图，从左至右标尺刻度依次为：5 μ m、5 μ m、3 μ m、1 μ m ;
[0065] 图6是本发明三种不同孔径的智能响应水凝胶本身的粘度比较，以及各自在对目 标物病毒进行响应后的粘度变化情况；图中均值和误差棒（标准误差）均是基于三次重复 实验的结果。
[0066] 图7是本发明适配体传感器在检测过程中，（a)对检测步骤调整优化结果图，（b) 对核酸适配体浓度优化结果图，以及（c)对孵育时间的优化结果图。结果表明同时添加信 号报告分子试剂和被测物溶液到水凝胶中，适配体浓度为1 μΜ，以及孵育时间为30分钟 时，传感器响应得到较高的灵敏度；图中均值和误差棒（标准误差）均是基于三次重复实验 的结果。
[0067]图8是本发明适配体传感器的性能评价结果图，其中（a)采用6种其他禽流感病 毒〇15吧、!15吧、!1謂1、!12吧、!14呢和!17吧）对此针对!15附的适配体传感器的专一性评价试 验结果图，（b)为通过比较该传感器在4摄氏度冰箱中储存3个月后对同一样品的检测结 果，评价其储存稳定性的试验结果图。图中均值和误差棒（标准误差）均是基于三次重复 实验的结果。
【具体实施方式】
[0068] 下面结合说明书附图，对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
[0069] 如图1所示，本发明所述的一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1 的荧光适配体传感器，首先合理地选择了对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配 体作为生物识别元件，通过对其5'末端修饰丙稀酰胺基（Acrydite)，对其3'末端修饰修饰 荧光淬灭基团Iowa BlackRQ，进行功能化修饰；其次，针对性设计可与核酸适配体互补的 单链DNAi和单链DNA2，并在单链DNAi的5'末端修饰丙烯酰胺基，在单链DNA 2的5'末端修饰 荧光量子点。丙烯酰胺基修饰的DNA在引发剂的催化下能够聚合形成含有多条DNA支链的 聚丙烯酰胺链。核酸适配体与单链DNA^l之间的碱基互补配对发挥了交联剂的作用，使两 种聚合物链相互连接，从而形成水凝胶。当不存在目标物时，由于DNA链之间的杂交作用， 凝胶处于收缩状态，量子点由于距离淬灭剂很近其荧光被淬灭；而当目标物存在时，适配体 与目标物的结合导致处于杂交状态的两段DNA序列相互分解，使得凝胶溶胀，造成量子点 与淬灭剂之间的距离增大，从而量子点荧光恢复，实现了对目标物进行无标记的定量检测。 [0070] 实施例1、一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传 感器的制备方法，具体如下：
[0071] -、制备单链DNA2_量子点耦合物
[0072] 将单链DNA2(80yL，5yM)与量子点溶液（16yL，l μΜ)混于一小离心管中，在室 温搅拌条件下孵育30min，保存于4°C备用。
[0073] 所述单链 0熟2的序列为：5' _/5Biosg/CAA CAG GAC AAC-3'。
[0074] 所述量子点溶液的配方为：硒化镉/硫化锌CdSe/ZnS核壳型半导体荧光量子点， 溶剂为硼酸盐缓冲液（〇. 05M，pH 7. 4)，最大发射波长为626nm。
[0075] 二、制备单链DNAf适配体聚合物水凝胶：
[0076](1)、配置0· 2% (质量％ )的丙烯酰胺水溶液作为储备液；
[0077](2)、配置引发剂-催化剂混合溶液：首先将0. 5mL去离子水通氮气lOmin，然后加 入0. 05g过硫酸铵和25 μ L四甲基乙二胺溶液，接着连续通氮气lOmin，备用；
[0078] 备注说明：通氮气的作用是去除溶液中溶解的氧，以下同；
[0079](3)、制备适配体-丙烯酰胺聚合物作为溶液I:将适配体溶液（200μL，1μM)通 氮气5min，然后加入75μL步骤（1)制备而得的储备液和100μL的新鲜制备的步骤（2)的 引发剂-催化剂混合溶液，接着连续通氮气lOmin，备用；
[0080] 所述适配体为对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体，其具体为： 5' _/5Acryd/GTG TGC ATG GAT AGC ACG TAA CGG TGT AGT AGA TAC GTG CGG GTA GGA AGA AAG GGA AAT AGT TGT CCT GTT G/3IAbRQSp/-3'，参考文献 Wang et al.J. Virol. Methods，2013, 189, 362-369。
[0081] (4)、制备单链DNAi-丙烯酰胺聚合物作为溶液II:将单链DNAi溶液（200yL， 1 μ Μ)通氮气5min，然后加入75 μ L的步骤（1)所得的储备液和100 μ L的新鲜制备的步骤 (2)中的引发剂-催化剂混合溶液，接着连续通氮气10min，备用；
[0082] 所述单链 0嫩!的序列为：5' _/5Acryd/ATC CAT GCA CAC-3'。
[0083] (5)制备水凝胶：将步骤（3)所得的全部的溶液I以及步骤⑷所得的全部的溶 液II混合，然后连续通氮气lOmin，接着将其置于37°C过夜（约12小时）以挥发掉部分水 分，得到初始的水凝胶；取其中部分的初始的水凝胶（80 μ L)置于95°C变性lOmin，立即取 出，置于室温30min (自然降温至室温），备用。
[0084] (6)此法制备得到的水凝胶记为水凝胶A。参照同样的方法，按照单体丙烯酰胺用 量1 :10 :100(A :B :〇的比例，制备另外两种水凝胶B和C。
[0085] 即，将上述步骤（1)中的0.2% (质量％ )改成2% (质量％ );其余等同，从而获 得水凝胶B ;
[0086] 同理，上述步骤（1)中的0.2% (质量％ )改成20% (质量％ );其余等同，从而 获得水凝胶C。
[0087] 对上述3种水凝胶（水凝胶A、水凝胶B、水凝胶C)的各项性能检测如下：
[0088] 一、依据常规的荧光法进行检测：
[0089] 如图3所示，利用三种制备得到的不同单体浓度的水凝胶，对不同浓度（2°、22、2 4 和26HAU)的禽流感病毒H5N1进行检测，发现水凝胶C对病毒浓度变化的响应趋势与水凝 胶A和B正好相反，结果如图3(a)所示。因此，本发明大胆提出和详细探讨了两种基于水 凝胶尺寸依赖特性的检测机理，分别是：若水凝胶结构性孔径尺寸相对目标物和信号报告 分子足够大，那么它们可以自由通过孔径，使得适配体与目标物反应引发荧光信号改变，表 现为目标物越多，被淬灭的量子点越少，荧光信号越强（水凝胶A和B);若水凝胶结构性孔 径尺寸足够小，阻碍了目标物和信号报告分子自由进入水凝胶内部，使得目标物只能先与 处在水凝胶网状结构外层的适配体反应，使得外层凝胶发生溶胀，扩大了外层凝胶孔径，有 利于信号报告分子和更多目