体金快速检测试纸条实物检测示意图；水稻白叶枯病菌(NCPPB 3002，来自湖南省进出口检验检疫局)
[0041]附图标记说明:1、2X106cfu/mL NCPPB 3002 菌体浓度；2、3.3 X 105cfu/mLNCPPB 3002 菌体浓度；3、lX105cfu/mL NCPPB 3002 菌体浓度；4、3.3X 104cfu/mL NCPPB3002菌体浓度；5、lX104cfu/mL NCPPB 3002菌体浓度；6、空白样。
[0042]图4本实用新型水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条实物检测示意图；水稻细菌性条斑病菌(NCPI3B 1585，来自湖南省进出口检验检疫局)
[0043]附图标记说明:1、1X107cfu/mL NCPPB 1585 菌体浓度；2、I X 106cfu/mL NCPPB1585 菌体浓度；3、5X105cfu/mL NCPPB 1585 菌体浓度；4、I X 105cfu/mL NCPPB 1585 菌体浓度；5、空白样。
【具体实施方式】
[0044]实施例1
[0045]如图1所示，一种水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条，包括PVC底板1，在PVC底板I两端分别设有样品垫3和吸水垫7 ；
[0046]在PVC底板I中部设有硝酸纤维素膜检测层2，在硝酸纤维素膜检测层2与样品垫3之间设有金标垫4 ;在金标垫4 一端与样品垫3相叠加,金标垫4另一端叠加在硝酸纤维素膜检测层2上；
[0047]在硝酸纤维素膜检测层2上按先后顺序设有检测线T线5和质控线C线6。
[0048]所述金标垫4上包被有金标标记群性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体3D2 ;所述检测线T线5上包被有群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体4D11 ;所述质控线6上包被有羊抗鼠IgG。
[0049]实施例2
[0050]所述水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，其步骤是:
[0051](I)群选性的单克隆抗体的制备
[0052]采用水稻白叶枯病菌(NCPPB 3002，来自湖南省进出口检验检疫局)菌体经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周进行首免,IX 18Cfu水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，I X 18Cfu水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，I X 17 cfu水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，分别挑选对水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体效价最高的老鼠；第九周进行冲刺免疫，I X 17Cfu水稻白叶枯病菌NCPPB 3002菌体/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后分别眼眶采血后进行融合、筛选，共筛选到10个细胞株。
[0053](2)群选性单克隆抗体的配对筛选
[0054]将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，确定免疫胶体金快速检测试纸条所需要的抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的群选性抗病菌抗体；其中3D2为金标抗体，4D11为包被抗体；
[0055](3)水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条的制备:
[0056]a.空白胶体金的制备:
[0057]采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在锥形瓶中加入200mL去离子水和2mL 1%氯金酸，搅拌加热至沸腾，快速加入4mL 1%朽1檬酸钠,继续加热15~20min,至呈亮红色,然后室温中冷却，4 C冷减保存；
[0058]b.胶体金标记抗体的制备:
[0059]空白胶体金溶液用0.1M K2CO3调节pH值至7.4，搅拌中滴加适量浓度步骤(2)制备的抗体，每mL胶体金加入30 μ g抗体(3D2),继续搅拌30 min,离心,吸取上清,用金标抗体保存液(0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液)重旋；
[0060]c.金标垫的制备:
[0061]调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将lmg/mL标记好胶体金的群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(3D2)均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.6 μ L/cm, 37 °C烘干过夜，封袋备用；
[0062]d.包被膜的制备:
[0063]调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将lmg/mL群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(4D11)均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将羊抗鼠IgG抗体均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量均为0.6μ L /cm，37°C烘干过夜，封袋备用。
[0064]将PVC底板、样品垫、金标垫、涂有检测线与质控线硝的酸纤维素膜检测层、和吸水垫组合，即得产品水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条。
[0065]本实用新型试纸条的工作原理:采用胶体金免疫层析技术，选用水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌群选性特异性抗体作为固相物，利用双抗体夹心法原理检测样品中是否含有水稻白叶枯病菌和/或水稻细菌性条斑病菌。当待检样品中含有水稻白叶枯病菌和/或水稻细菌性条斑病菌时，抗原先和胶体金标记的群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(3D2)结合，由于层析作用复合物沿包被膜向前移动，当遇到检测线上的群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体(4D11)时，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，在检测线上富集，形成红色沉淀线。
[0066]检测时按如下步骤处理检测样品:取1g种子，先用蒸馏水冲洗以除去残片和表面污染杂菌，后放入0.001%吐温-磷酸缓冲液中低温(5°C ~ 15°C)浸泡4 h ~ 6 h，用均质器打碎，制备样品提取液。提取液于22°C ~ 25°C环境中放置4 h ~ 6 h，旋窝混匀悬浮液5min,进行检测。
[0067]检测时如样品为阴性，则试纸条只有质控线C线显色(图3中6号，图4中5号)；如果样品为阳性，及水稻白叶枯病菌浓度大于IX 104cfu/mL和/或水稻细菌性条斑病菌浓度大于I X 105cfu/mL,则试纸条质控线C线，检测线T线均显色。如果试纸条C线不显色，则说明试纸条质量出现问题。
【主权项】
1.一种水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于:在PVC底板(I)两端分别设有样品垫(3)和吸水垫(7)； 在PVC底板(I)中部设有包含检测线(5)和质控线(6)的硝酸纤维素膜检测层(2)，在硝酸纤维素膜检测层(2 )上依次设有包被有群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体4D11的检测线(5)和包被有羊抗鼠IgG的质控线(6)； 在硝酸纤维素膜检测层(2)与样品垫(3)之间设有包被有金标标记群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体3D2的金标垫(4);金标垫(4)一端与样品垫(3)相叠加，金标垫(4)另一端叠放在硝酸纤维素膜检测层(2)上。
【专利摘要】本实用新型涉及一种水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的二合一免疫胶体金快速检测试纸条，属于免疫检测技术领域。该试纸条由PVC底板、样品垫、涂覆金标标记群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体（3D2）的金标垫、在检测线包被有群选性抗水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌抗体（4D11）和在质控线包被有羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、及吸水垫构成。该试纸条操作简便、快速、准确，全过程只需5min，不受环境条件的干扰，特异性好，检测灵敏度高，对水稻白叶枯病菌最低检测限为1×104cfu/mL，对水稻细菌性条斑病菌最低检测限为1×105cfu/mL。本实用新型适用于海关、粮仓、企业、检验检疫单位等，可实现粮食或种子样本中该病菌的快速检测。
【IPC分类】G01N33-558, G01N33-569
【公开号】CN204287191
【申请号】CN201420718740
【发明人】徐丽广, 孔德昭, 胥传来, 匡华, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年11月26日