一种炎症指标检测板及炎症检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于免疫监测技术领域，具体是涉及一种炎症检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 炎症是诸多疾病的征兆，是机体对外来物、病原体、组织损伤、自身免疫性疾病W 及其他有害刺激的保护性反应。炎症的表现包括；血管舒张、血管通透性增加、血液涌入、血 浆渗漏、嗜中性粒细胞和巨瞻细胞浸润和活化涌入。该也是为什么炎症往往伴随着局部组 织发烧、红肿等症状。炎症反应在限制外来物质、吞瞻病原体和组织碎片中起重要作用。急 性炎症是初始相位，是为了消除入侵的外来物质、病原体和其他有害刺激；然而，如果刺激 持续存在，急性炎症就会发展成慢性炎症。在慢性炎症过程中，组织会不停地被破坏、细胞 类型会被不断被轮换。炎症过程受多种细胞因子调控，而细胞因子的类型会因炎症的原因， 位置和严重性而不同。因此，检测细胞因子的类型和含量对理解炎症及其背后的疾病有非 常重要的意义。
[0003] 降巧素原（procalcitonin，PCT)是诊断和监测细菌性感染炎症的特异性指标。 PCT是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染W及賊毒症和多脏器功能衰竭时，它在血 浆中的水平升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用。
[0004] 白细胞介素-6(interle址in-6,比-6)作为一种细胞因子，是一种在白细胞或免 疫细胞间相互作用的淋己因子，可W鉴定急性炎症。IL-6有刺激肝细胞产生一系列急性 期蛋白的作用，参与炎症反应和发热反应，某些人体肿瘤细胞、特别是骨髓瘤细胞，可分泌 IL-6作为自身生长因子刺激其生长。
[000引 白细胞介素-18(interle址in-18,比-18)是从小鼠及人的肝细胞中克隆得到的 一种新的细胞因子，人的IL-18主要由单核-巨瞻细胞产生，主要介导细胞免疫反应，可用 于鉴定自身免疫性炎症。比-18可刺激Thl细胞分泌多种细胞因子，促进Thl细胞增殖，诱 导调节Thl细胞的分化成熟和促进Thl细胞为主的细胞免疫反应；并增强NK细胞的溶解活 性，既可促进Fas-FasL配体介导的NK细胞的细胞毒活力，又可促进穿孔素介导的NK细胞 对祀细胞传统杀伤活性。
[0006] 干扰素（Interferon, IFN)是动物细胞在受到某些病毒感染后分泌的具有抗病毒 功能的宿主特异性糖蛋白。细胞感染病毒后分泌的干扰素能够与周围未感染的细胞上的相 关受体作用，促使该些细胞合成抗病毒蛋白防止进一步的感染，从而起到抗病毒的作用。 干扰素-Y (Interferon-Y，IFN-y)是由免疫系统中的T细胞和自然杀伤细胞产生的一种 水溶性二聚体细胞因子，是II型干扰素的唯一成员。最初叫巨瞻细胞活化因子。
[0007] 目前临床上用于检测判断炎症的指标不多，而且是单项检测，与疾病关联的特异 性不强，比如，血液中白细胞升高被视为炎症的金指标，但对于分析什么类型炎症，什么原 因引起的炎症却无能为力。因此，检测是否有炎症，并且帮助分析炎症类型，比如：病毒性炎 症、细菌性炎症、急性炎症、自身免疫疾病炎症，非常有助于疾病的早期发现和诊断。
【发明内容】
[0008] 本实用新型要解决的问题是提供一种炎症指标联检试剂盒，不仅适合于检测是否 有炎症，还能帮助分析炎症类型，有助于疾病的早期发现和诊断。
[0009] 为解决上述技术问题，本实用新型采用的技术方案是；一种炎症指标检测板，检测 板上设置由4列8行连排检测孔组成的矩阵孔，矩阵孔的上方自左至右分别标记有；PCT、 IL6、IL8、IFN-Y，矩阵孔的左边自上而下分别标记有：阳性对照、阴性对照、试样1、试样2、 试样3、试样4、试样5、空白，矩阵孔自左至右纵列是分别经过PCT、IL6、IL18、IFN-y4种指 标蛋白或其抗体包被过的。
[0010] 一种炎症检测试剂盒，包括上述的检测板、装有组合反应液的试剂管、装有组合阳 性对照液的试剂管、装有组合阴性对照液的试剂管，所述组合反应液是同时含有2-4种能 与待测指标蛋白结合的预标记抗体混合液。
[0011] 进一步的，所述组合反应液是同时含有2-4种能与待测指标蛋白结合的预标记受 体蛋白混合液。
[0012] 进一步的，所述待测指标蛋白为；PCT、IL6、IL18、IFN-y。
[0013] 进一步的，所述组合阳性对照液中各蛋白浓度为；500-10(K)pg/ml PCT，30-6化g/ ml比-6，150-300pg/ml比-18，130-260pg/ml IFN-y ;所述组合阴性对照液中各蛋白浓度 为；0-500pg/ml PCT，0-30pg/ml 比-6,0-150pg/ml 比-18,0-130pg/ml IFN-y。
[0014] 进一步的，所述试剂盒中还包括装有样品稀释液的试剂瓶、装有显色液的试剂管 及装有洗涂液的试剂瓶。
[0015] 进一步的，所述样品稀释液含0. 4%巧樣酸H轴的缓冲液，所述的缓冲液是PBS或 lO-lOOmM的磯酸缓冲液。
[0016] 一种制备上述炎症检测试剂盒的方法，其特征在于；包括如下步骤：
[0017] (1)制备检测板；
[0018] (2)配制组合反应液；
[0019] (3)配制组合蛋白的标准品
[0020] 1)配制组合阳性对照液；
[0021] 2)配制组合阴性对照液；
[0022] (4)配制样品稀释液
[0023] 将巧樣酸H轴溶解于PBS缓冲液，调抑值至7. 4,制成含0. 4%巧樣酸H轴的PBS 缓冲液，分装后低温储存备用；
[0024] 妨配制显色液
[00幼取TMB (3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺）20mg与100ml的10mM(pH4)巧樣酸缓冲液混 合，再加入3%过氧化氨溶液1ml，充分混匀后，分装后避光低温储存备用。
[002引 做配制洗涂液
[0027] 取PBS溶液1L，加入1ml吐温20 (Tween20)，充分混匀，分装后低温储存备用。
[002引 （7)取上述步骤（1)-做所制备的检测板1个、组合反应液1管、组合阳性对照液 1管、组合阴性对照液1管、样品稀释液1瓶、显色液1管、洗涂液1瓶，合装于一个盒子内， 得到炎症检测试剂盒。
[0029] 进一步的，所述检测板由如下步骤制备得到：
[0030] (1)制模，用透明聚丙帰或聚苯己帰塑料压模制得，矩阵孔的上方自左至右分别标 记检测指标蛋白名称，矩阵孔的下方自左至右分别标记数字编号，矩阵孔的左边自上而下 分别标记分组名称；
[0031] (2)按照多克隆抗体制备方法、单克隆抗体制备方法或购买得到检测指标蛋白的 抗体，用0. 1M，pH = 8的Tris缓冲液分别将蛋白的特异抗体配制成浓度为1 y g/ml抗体包 被液；
[003引 做在检测孔内分别按照标记的名称添加100 上述抗体包被液，在室温下赔育 化后，倒空板，用PBS冲洗各孔3次，然后，在各孔内添加200 ill的2% BSA-PBS封闭 液，在室温下赔育化，用PBS冲洗各孔3次，然后，在45C下干燥，将该检测板抽真空密 封于铅袋内，储存在低温干燥冰箱备用。
[0033] 进一步的，所述组合反应液由如下步骤制备得到：
[0034] (1)将邸C、HRP、检测指标蛋白单克隆抗体按摩尔数20 ;1 ;1溶解于PBS缓冲液， 并在室温反应化；
[00巧]2)通过透析去除游离的邸C，进一步通过HPLC纯化获得高纯度HRP-检测指标蛋 白抗体偶联物；
[0036] 3)分别制备得到HRP-PCT抗体偶联物、HRP-IL6抗体偶联物、HRP-IL18抗体偶联 物、HRP-IFN- Y抗体偶联物中的2-4种；
[0037] 4)取10ml含有1 % BSA的PBS溶液，逐个加入步骤3)中的HRP-PCT检测指标蛋 白抗体，充分混匀得到组合反应液，分装后低温储存备用。
[003引进一步的，所述组合蛋白的标准品由如下步骤制备得到：
[0039] (1)配制组合阳性对照液；选用纯化的并经准确定量的W下2-4种检测指标蛋白， 按照下述各蛋白浓度用含有1 % BSA的PBS溶液溶解配制而成，分装后低温储存备用，各 蛋白浓度；PCT 500-1000pg/ml，比-630-60pg/ml，比-18150-300pg/ml, IFN- Y 130-260pg/ ml ；
[0040] (2)配制组合阴性对照液；选用纯化的并经准确定量的w下2-4种检测指标蛋白， 按照下述各蛋白浓度用含有1% BSA的PBS溶液溶解配制而成，分装后低温储存备用，各蛋 白浓度；PCT 0-500pg/ml，比-6〇-30pg/ml，比-18〇-150pg/ml, IFN-y〇-130pg/ml。
[0041] 本实用新型具有的优点和积极效果是；可在一次试验中同时检测多个炎症检测指 标，从而实现快速鉴别炎症类型，而且使得所测得的各指标的含量及其比例关系更具可比 性，因此能更准确地用于鉴别炎症类型及其关联的疾病。
【附图说明】
[0042] 图1是本实用新型试剂盒的结构示意图；
[0043] 图2是本实用新型的检测板的正视图；
[0044] 图3是本实用新型实施例12中炎症指标标准曲线。
[004引图1、图2中；1.检测板，2.检测孔，3.装有组合反应液的试剂管，4.装有组合阳 性对照液的试剂管，5.装有组合阴性对照液的试剂管，6.装有样品稀释液的试剂瓶，7.装 有显色液的试剂管，8.装有洗涂液的试剂瓶。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合具体实施例对本实用新型作进一步说明，但不限定本实用新型的保护范 围。
[0047] 实施例1
[0048] 一