于37 °C、5% CO2 培养箱中培养。培养1〇~14天，用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性孔筛选，选择强 阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行2~3次有限稀释克隆化，将阳性孔扩大培养后建立 杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法获得腹水，再经纯化得到鼠源单克隆抗体，纯化方 法采用上述兔源多克隆抗体制备中的饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法。
[0026] 通过ELISA饱和法测定鼠源单克隆抗体的亲和常数能够达到109L/mol。利用 Sigma鼠源单克隆抗体亚型鉴定试剂，鉴定出该单克隆抗体的亚型为IgGl型。
[0027] 单克隆抗体的特异性：首先采用间接竞争ELISA测定与其他大豆蛋白的交叉反 应率进行鉴定，这几种大豆蛋白竞争物包括大豆球蛋白（glycinin)、β -伴大豆球蛋白 (β -conglycinin)、大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子和大豆凝集素，以BBI的半数抑制浓度 (IC5。）与各竞争物的IC 5。的百分比作为交叉反应率，结果如表1所示，单克隆抗体与这几种 大豆蛋白竞争物之间基本没有交叉反应，结果表明其对于BBI具有良好的特异性。
[0028] 表1 BBI鼠源单克隆抗体与竞争物的交叉反应
[0030] 3、样品垫的制备
[0031] 样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜或聚酯膜制备，将纤维材料 剪成宽I. 5cm规格的条带，将其放入样品垫封闭液中浸泡30min，于37°C烘干，备用。
[0032] 4、结合垫的制备
[0033] 采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，即在沸腾的0. 01~0. 02%氯金酸溶液中加 入1%的新配制柠檬酸钠溶液，获得直径15~20nm的胶体金溶液，用0· lmol/L的1(20)3调节 pH值至8. 5~9. 5,置2~8°C保存备用。以I :2000的标记比将待标记的BBI鼠源单克隆抗体加 入pH 8. 5~9· 5的胶体金溶液中，标记30min后，加入10%的BSA，静置30min，4°C、13000rpm 离心30min弃上清。沉淀用含2% BSA的0. 02mol/L四硼酸钠溶液复溶，4°C、13000rpm离 心30min弃上清。将胶体金纳米颗粒沉淀用25mL的TB重悬液(重悬液组成：0. 02mol/L四 硼酸钠溶液中含1%的BSA和0. 03%的叠氮钠)重悬，获得胶体金标记的BBI鼠源单克隆抗 体。将2~5倍稀释的胶体金标记抗体喷点于玻璃纤维绵上制备结合垫，56°C干燥后密封避 光保存。
[0034] 5、纤维素膜的制备
[0035] 纤维素膜用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜，剪切成宽I. 5cm规格的 条带，用点样仪在纤维素膜上不同位置分别喷点BBI兔源多克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体 (或兔抗小鼠IgG抗体)，制作隐形的检测线和质控线，于40°C烘干后用2% BSA溶液充分封 闭，室温干燥后密封避光保存备用。
[0036] 其中羊抗小鼠IgG (或兔抗小鼠IgG)抗体的制备方法如下：
[0037] 首先利用饱和硫酸铵盐析法提取BBI阴性小鼠血清IgG，然后以20(^g~50(^g/只 的剂量经皮下或肌肉注射清洁级山羊或新西兰大白兔3~4次，末次免疫30天后，以ELISA 测定其血清效价达到1:10000以上时，心脏或动脉采血，分离收集高免血清，以饱和硫酸铵 盐析法亲和层析法提取羊抗小鼠或兔抗小鼠IgG抗体，用于BBI检测试纸质控线的喷点。
[0038] 6、免疫层析试纸的组装：
[0039] 将样品垫、结合垫、纤维素膜、吸水垫从左至右依次黏贴在带有粘合剂的支撑层 上，彼此交界处重叠2~3mm，然后切成3~4mm宽的试纸即可。
[0040] 7、免疫层析试纸的检测原理：
[0041] 当试纸测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测BBI及结合 垫中的金标抗体一起向纤维素膜扩散，并最终渗入手柄端的吸水材料层。在扩散过程中，待 测BBI可先与金标单抗相结合，进而与纤维素膜上喷点的BBI兔源多克隆抗体检测印记结 合，显示检测线，形成红色检测线带" I ";纤维素膜上喷点的羊或兔抗小鼠IgG抗体质控印 记也可与金标抗体结合，形成红色质控线带" I "，即两条红色线带" I I "表示为阳性；反之 样品溶液中无BBI时，则不能与金标抗体结合，同样也不能与纤维素膜上喷点的BBI兔源多 克隆抗体检测印记结合，不显示红色检测线带，而纤维素膜上喷点的羊或兔抗小鼠IgG抗 体质控印记可与金标抗体结合，显示红色质控线带" I "，形成一条红色带" I "表示为阴性。 如果纤维素膜上没有任何红色线带显示，则表明试纸已失效。
[0042] 以下用实例具体说明本实用新型试纸的结构、检测方法及特性。
[0043] 实施例一：参见图1和图2。图中1为支撑层，用塑胶薄片条制成；2为样品垫，用 玻璃纤维棉制成；3为结合垫，吸附有胶体金纳米颗粒标记的BBI鼠源单克隆抗体的玻璃纤 维棉；4为纤维素膜，采用硝酸纤维素膜；手柄端的吸水垫5用吸水滤纸制成。将样品垫2、 结合垫3、纤维素膜4、吸水垫5从左至右依次黏贴固定在支撑层1上，彼此之间交界处纤维 互相重叠。在纤维素膜4上设有隐形检测线6,用BBI兔源多克隆抗体溶液制成；隐形质控 线7用羊抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜上喷点制成，两条线带平行排列，形成组合印记带 "II"。
[0044] 8-1为覆盖在样品垫2和结合垫3上面的样品端白色保护膜，8-2为覆盖在吸水垫 5上面的其它颜色保护膜(如黄色)，9为样品标记线，该标记线位于样品垫2与结合垫3交 界处对应的白色保护膜上偏向样品垫2 -侧约0. 5cm处，在标记线左侧保护膜上印有箭头 及Max字样。
[0045] 待测样品的制备及检测步骤：
[0046] 检测脱脂奶粉：将样品用含有0.0 lmol/L NaHSO3的水溶液以1:15的料液比溶解 后，lmol/L的NaOH调pH至9. 0,在45°C水浴条件下搅拌lh，将混合溶液在常温下1000 Orpm 离心30min，分离上清液用于检测。
[0047] 操作方法：将BBI试纸样品端插入待测样品中，插入深度不超过标记线，约10~20 秒钟取出试纸，水平放置，IOmin后观察判定检测结果。
[0048] 结果判定：（a)阳性如果在纤维素膜上显示有两条红色印记带" I I "，表示检测 结果为阳性，说明在待测样品中含有BBI ;(b)阴性如果在纤维素膜上显示有一条红色印 记带" I "，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含BBI ;(c)失效如果在纤维素膜上 没有红色带显示，则表明试纸已失效。
[0049] 实施例二：试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于：样品垫2用尼龙膜制 成，纤维素膜4采用纯纤维素膜。
[0050] 检测饲料：先将样品进行粉碎，过60目筛，再用石油醚对粉碎后的样品进行脱脂 处理。随后的样品制备方法同实施例一。
[0051] 操作方法和结果判定同实施例一。
[0052] 实施例三：试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于：样品垫2用聚偏二氟乙 烯PVDF膜制成，隐形质控印记7用兔抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜上制成，纤维素膜4 采用羧化纤维素膜。
[0053] 检测饲料：样品制备方法同实施例二。
[0054] 操作方法和结果判定同实施例一。
[0055] 实施例四：试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于：样品垫2用聚酯膜制 成，纤维素膜4采用羧化纤维素膜。检测样品、操作方法和结果判定同实施例一。
[0056] 实施例五：试纸结构和实施例一基本相同，不同之处在于：样品垫2用尼龙膜制 成，隐形质控印记7用兔抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜上制成。检测样品、操作方法和结 果判定同实施例一。
[0057] 实施例六：本实用新型试纸的敏感性和特异性试验。
[0058] 敏感性：取十个梯度的BBI标准溶液，浓度分别为Ong/mL，50ng/mL，100ng/mL， 200ng/mL，400ng/mL，800ng/mL，1600ng/mL，3200ng/mL，6400ng/mL，12800ng/mL。各取上述 浓度的标准溶液l〇〇mL，用实施例一中的试纸进行检测，IOmin后观察结果，以检测线显色 结果评价试纸的敏感性。结果表明，试纸的灵敏度可以达到l〇〇ng/mL。
[0059] 特异性：用该试纸检测分别检测高浓度的glycinin、β -conglycinin、大豆 Kunitz胰蛋白酶抑制因子和大豆生凝集素，浓度为20mg/mL，结果检测线均不显色，说明该 试纸与这几种大豆蛋白均没有交叉反应，具有良好的特异性。
【主权项】
1. 一种快速检测大豆Bowman-Brik胰蛋白酶抑制因子BBI的胶体金免疫层析试纸，底 层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、结 合垫、纤维素膜和吸水垫，其特征在于：在纤维素膜设有用BBI兔源多克隆抗体溶液喷点的 隐形检测线以及用羊抗小鼠IgG抗体或兔抗小鼠IgG抗体溶液喷点的隐形质控线；所述结 合垫吸附有胶体金纳米颗粒标记的BBI鼠源单克隆抗体。2. 根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征是：所述支撑层用不吸水的韧性材 料制成；样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；结合垫用玻璃纤维 棉、聚酯膜、醋酸纤维或尼龙膜制成。3. 根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征是：所述纤维素膜用硝酸纤维素膜、纯 纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水垫用吸水滤纸或滤油纸制成。4. 根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征是：所述隐形检测线和隐形质控线为 平行排列的" I I "直线式印记。5. 根据权利要求1-4任一项所述的免疫层析试纸，其特征是：在所述样品垫、结合垫及 吸水垫上覆盖有保护层，在样品垫与结合垫交界处对应的保护层上喷点有样品标记线。
【专利摘要】本实用新型涉及一种快速检测大豆Bowman-Brik胰蛋白酶抑制因子的胶体金免疫层析试纸及制备方法，该试纸基于双抗体夹心的原理检测BBI，试纸含有支撑层、吸附层、保护层，吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫；结合垫吸附有BBI的特异性抗体，纤维素膜设有用BBI兔源多克隆抗体溶液喷点的检测线以及用羊抗小鼠IgG抗体或兔抗小鼠IgG抗体溶液喷点的质控线，BBI的特异性抗体采用胶体金纳米颗粒标记的BBI鼠源单克隆抗体。本实用新型的免疫层析试纸特异性强、灵敏度高，检测简便、直观、准确，成本低，适用范围广，易于推广应用。
【IPC分类】G01N33/02, G01N33/68
【公开号】CN204882524
【申请号】CN201520488733
【发明人】胡骁飞, 邢广旭, 王耀, 孙亚宁, 柴书军, 郝天红
【申请人】河南省农业科学院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年7月8日