专利名称：药肥两用土壤微生物菌剂木霉制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新型药肥两用土壤微生物菌剂——木霉制剂的制备方法，属于农业生物技术领域。
背景技术：
农作物的虫害、病害始终是严重影响农作物产量的重要因素，病虫害的发生使得农作物严重减产，甚至绝收，因此，对病虫害的有效控制非常重要。长期以来，我国农业以化学农药、化学杀菌剂为主防治病虫害，近20年来，化学农药的使用为保障我国农业的安全生产发挥了重要的作用。我国从80年代初开始，土地分田到户，农民耕种自己的责任田，这一措施的实施，最大限度的发挥了农民的劳动积极性。但由此导致农业耕作的协调性和集约性降低，尤其在病虫害的防治方面，协调性很差，导致化学农药、化学杀菌剂的过量施用和滥用，在防治农作物虫害的同时，各种害虫的抗(耐)药性大大增强，为了进一步防治害虫，农药用量不断加大，从而形成了恶性循环。植物病原菌是否象畜禽的病原菌那样，也对抗生素为主的化学杀菌剂具有抗性，至今研究的还较少。农药的过量施用和滥用，导致农药在农产品、土壤中残留过多，污染了环境，严重影响农产品的食用安全，成为我国农产品进入国际市场的主要制约因素之一。相对于虫害的防治，各种植物病害(真菌病、细菌病、病毒病)的防治难度更大，尽管使用大量的化学杀菌剂，但防治效果并不理想，作物抗病育种取得了一定的效果，但没有从根本上解决问题。近年来，我国农作物病害有愈演愈烈之势。表现在原有的病害危害越来越严重，新的病害不断出现。因此，植物病害已经成为农业生产的重要影响因素之一。寻求新的病害生物防治防治措施，高效防治各种植物病害，较少化学农药的用量，降低农产品中农药的残留，是目前急需解决的生产中的难题。
近年来，农业栽培过程中，由于化学肥料的大量使用，土壤中硝酸盐、亚硝酸盐的大量残留，农产品中化学的残留量增加，这是影响农产品质量的另一重要问题。同时，土壤中大量硝酸盐、亚硝酸盐的流失，污染了水源，对生态环境造成极大的破坏。因此，寻求使用高效的生物肥料，提高肥料利用效率，减少化肥的使用量，降低农产品中化肥残留，促进无公害农产品的生产，是当今我国农业生产中的又一迫切需求。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种药肥两用土壤微生物菌剂木霉制剂的制备方法。
本发明的木霉制剂的制备方法如下(1)采用能够以纤维素为唯一碳源快速生长，且高产真菌细胞壁降解酶(CWDEs)和抗生素哌珀霉素(peptaibols)的木霉菌株——哈茨木霉(Trichoderma harzianum RifaiACCC30371)为菌株，接种三角瓶液体菌种(二级菌种)，以麸皮汁为培养基，液体发酵灌发酵制备生产用液体菌种；(2)以玉米秸粉、小麦秸粉、麸皮为主要原料，配以硫酸铵和水，蒸球高温高压灭菌，接种步骤(1)所得的生产用液体菌种，转入无菌的固体发酵曲池，通无菌风，厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物；(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物，低温(50-80℃)烘干，粉碎，加入分生孢子的保护剂，即得到木霉制剂。
步骤(3)中所述的分生孢子的保护剂选自褐藻胶。
下面对本发明的木霉制剂的制备方法的各步骤具体说明如下(1)生产用液体菌种的制备培养基麸皮9～11份、土豆4～6份，水100份，均为重量份，下同。煮沸，过滤，加蛋白胨0.41～0.6份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、灭菌，冷却，接种哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371)的二级液体菌种，5～10份，通风搅拌，培养24～36小时，做为生产用液体菌种待用。
(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物原料玉米秸粉和/或小麦秸粉30～40份，麸皮60～70份，硫酸铵1～2份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶2.8～3.0(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种5～7份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，24～30小时翻曲一次，发酵4～5天，即得到木霉分生孢子的培养物。
该木霉分生孢子培养物，孢子数可达到5亿/g干品，发酵物纤维素酶活性(CMC酶活性)可达到150～200IU/g干品，木聚糖酶活性达到1200IU/g干品，哌珀霉素含量达到5～10mg/kg干品。
(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经50-80℃干燥后，按重量份0.9～1.1份木霉分生孢子培养物添加0.4～0.5份褐藻胶，做为保护剂，最后，经粉碎、质检、包装成品。
上述哈茨木霉的二级液体菌种制作可按已有技术。本发明提供如下具体操作步骤A. 斜面菌种(固体)将土豆去皮洗净，切成小片，放在水中，土豆∶水＝1∶(3～6)重量比，80±1℃浸泡1小时，或煮沸半小时，用滤布煮沸过滤，滤液加水稀释至原来的体积。再加糖1～2份，琼脂1.5～2份，自然pH值，8磅灭菌。划线接种哈茨木霉(Trichoderma harzianum RifaiACCC30371)菌株，28～30℃培养。
B.二级菌种(液体)培养基配方同斜面，只不加琼脂，自然pH值，装瓶，8磅灭菌，接斜面菌种的菌悬液3～5％重量百分比，28～30℃下，摇床培养。
本发明以高效生防用木霉为菌株，利用玉米秸杆、麦秸、麦麸等廉价原料，利用液体深层发酵技术，发酵生产液体菌种，然后应用厚层通风固体发酵技术，在近似GMP的无菌条件下，发酵生产木霉分生孢子制剂，做为土壤微生物菌剂，应用防治多种植物土传病害，同时，该菌剂能够促进植物生长，提高肥料利用率，诱导植物产生抗逆境和抗病害的能力效果优良，可产生很好的经济社会效益。
本发明的优良效果在于选用能够以纤维素、半纤维素为唯一碳源快速生长，并且高产植物病原真菌细胞壁降解酶(CWDEs)和抗生素哌珀霉素(peptaibols)的木霉菌株，利用液固两相结合发酵工程技术，在近似GMP的无菌环境中，发酵生产木霉分生孢子制剂。该菌株能够以纤维素、半纤维素为唯一碳源快速生长，使得该菌株施用后能够在土壤中快速定植，这是菌剂在土壤中发挥作用的先决条件。菌株高产CWDEs，可高效抑制多种土传的植物病原真菌，高产抗生素派珀霉素，从而可高效抑制多种土传的植物病原细菌和真菌，CWDEs和peptaibols原位协同作用，可进一步加强该木霉菌株对植物病原菌的抑制作用。该木霉制剂，能够提高化肥用量，促进植物生长，诱导植物产生抗逆境和抗病害的能力，从而可减少化肥和化学农药的用量，降低农产品中化肥和农药的残留，符合目前对无公害农产品生产的迫切需求。农作物秸杆是储量巨大的农业废弃物资源之一，到目前为止，因为没有有效的资源化利用技术，使得这一资源的利用率很大，每年的大量秸杆被焚烧，不仅浪费了资源，而且对空气造成了严重的污染，成为我国目前亟待解决的问题。该工艺在开发利用秸杆资源的的同时，无三废排出，避免秸杆焚烧对环境造成的的严重污染，是一条农业废弃物资源化、高值化、生态化利用的有效途径。
具体实施方式
实施例1哈茨木霉的二级液体菌种的制备，具体操作步骤如下A.斜面菌种(固体)将土豆去皮洗净，切成小片，放在水中，土豆∶水＝1∶4重量比，80℃浸泡1小时，用滤布煮沸过滤，滤液加水稀释至原来的体积。再加糖2份，琼脂1.5份，自然pH值，8磅灭菌。划线接种哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371)菌株，28～30℃培养。
B.二级菌种(液体)培养基配方同斜面，只不加琼脂，自然pH值，装瓶，8磅灭菌，接上述斜面菌种的菌悬液3～5％重量百分比，28～30℃摇床培养。
实施例2木霉制剂的制备(1)生产用液体菌种的制备培养基麸皮10份、土豆5份，水100份，均为重量份，下同。煮沸，过滤，加蛋白胨0.5份、Na2HPO40.45份、KH2PO40.035份、灭菌，冷却，接种哈茨木霉(Trichodermaharzianum Rifai ACCC30371)的二级液体菌种6份，通风搅拌，培养30小时，做为生产用液体菌种待用。
哈茨木霉的二级液体菌种的制备如实施例1所述。
(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物原料玉米秸粉10份和小麦秸粉20份，麸皮65份，硫酸铵1份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶2.8(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种6份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，24小时翻曲一次，发酵4天，即得到木霉分生孢子的培养物。
该木霉分生孢子培养物，孢子数5亿/g干品，发酵物纤维素酶活性(CMC酶活性)180IU/g干品，木聚糖酶活性达到1200IU/g干品，哌珀霉素含量达到6mg/kg干品。
(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经75℃干燥后，按重量份1份木霉分生孢子培养物添加0.4份褐藻胶做为保护剂，经粉碎、质检、包装成品。
实施例3木霉制剂的制备如实施例2所述，所不同的是(1)生产用液体菌种的制备培养基麸皮11份、土豆6份，水100份，均为重量份，下同。煮沸，过滤，加蛋白胨0.6份、Na2HPO40.5份、KH2PO40.04份、灭菌，冷却，接种哈茨木霉(Trichodermaharzianum Rifai ACCC30371)的二级液体菌种10份，通风搅拌，培养34小时，做为生产用液体菌种待用。
(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物原料小麦秸粉35份，麸皮70份，硫酸铵2份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶3.0(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种7份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，25小时翻曲一次，发酵4.5天，即得到木霉分生孢子的培养物。
其他同实施例2。
实施例4木霉制剂的制备如实施例2所述，所不同的是步骤(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物原料玉米秸粉20份和小麦秸粉20份，麸皮70份，硫酸铵2份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶2.8(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种5.5份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，28小时翻曲一次，发酵5天，即得到木霉分生孢子的培养物。
实施例5木霉制剂的制备如实施例2所述，所不同的是步骤(3)是将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经80℃干燥后，按重量份1.1份木霉分生孢子培养物添加0.5份褐藻胶做为保护剂，最后，经粉碎、质检、包装成品。
权利要求
1.一种木霉制剂的制备方法，包括步骤如下(1)以纤维素为唯一碳源快速生长，且高产真菌细胞壁降解酶和抗生素哌珀霉素的哈茨木霉ACCC30371为菌株，接种三角瓶液体菌种，以麸皮汁为培养基，液体发酵灌发酵制备生产用液体菌种；(2)以玉米秸粉、小麦秸粉、麸皮为主要原料，配以硫酸铵和水，蒸球高温高压灭菌，接种步骤(1)所得的生产用液体菌种，转入无菌的固体发酵曲池，通无菌风，厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物；(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物，50-80℃烘干，粉碎，加入分生孢子的保护剂，即得木霉制剂。
2.如权利要求1所述的木霉制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的分生孢子的保护剂选自褐藻胶。
3.如权利要求1所述的木霉制剂的制备方法，其特征在于步骤(1)生产用液体菌种的制备具体如下培养基麸皮9～11份、土豆4～6份，水100份，煮沸，过滤，加蛋白胨0.41～0.6份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、灭菌，冷却，接种哈茨木霉ACCC30371的二级液体菌种，5～10份，通风搅拌，培养24～36小时，做为生产用液体菌种待用，以上均为重量份。
4.如权利要求1所述的木霉制剂的制备方法，其特征在于步骤(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物具体如下原料玉米秸粉和/或小麦秸粉30～40份，麸皮60～70份，硫酸铵1～2份，润水，原料∶水＝1∶2.8～3.0，重量比，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种5～7份，以上均为重量份，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，24～30小时翻曲一次，发酵4～5天，即得到木霉分生孢子的培养物。
5.如权利要求1或2所述的木霉制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)具体如下将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经50-80℃干燥后，按重量份0.9～1.1份木霉分生孢子培养物添加0.4～0.5份褐藻胶，做为保护剂，经粉碎、包装成品。
全文摘要
一种药肥两用土壤微生物菌剂木霉制剂的制备方法，属于农业生物技术领域。制备方法包括以哈茨木霉ACCC30371为菌株，接种三角瓶液体菌种，以麸皮汁为培养基，发酵灌发酵制备生产用液体菌种；以秸粉、麸皮为原料，配以硫酸铵和水，高温高压灭菌，接种液体菌种，转入无菌的固体发酵曲池，厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物；将木霉分生孢子培养物，烘干，粉碎，加入分生孢子的保护剂，即得。本发明以高效生防用木霉为菌株，利用秸秆、麦麸等廉价原料，在近似GMP的无菌条件下，发酵生产木霉分生孢子制剂，做为土壤微生物菌剂，应用防治多种植物土传病害，同时，该菌剂能够促进植物生长，提高肥料利用率，诱导植物产生抗逆境和抗病害的能力。
文档编号A01N63/04GK1632101SQ20041003641
公开日2005年6月29日 申请日期2004年11月26日 优先权日2004年11月26日
发明者张玉忠, 孙彩云, 宋晓妍, 解树涛, 陈秀兰 申请人:山东大学