β－隐黄质的用途的制作方法

专利名称：β－隐黄质的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及β-隐黄质(β-cryptoxanthin)在人类和动物中的用途。更特别地，本发明涉及β-隐黄质用于制造下述组合物的用途，所述组合物用于促进增加的蛋白形成和/或预防蛋白损失。另一方面，本发明涉及在人类和动物中促进增加的蛋白形成和/或预防蛋白损失的方法，所述方法包括向所述人类或动物施予有效量的β-隐黄质。
本文中使用的术语“β-隐黄质”包含天然来源的β-隐黄质或合成制备的β-隐黄质。天然来源的β-隐黄质(更具体地，(全-E)β-隐黄质)可以含有饱和及不饱和脂肪酸的β-隐黄质酯(主要是月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯)，以及异构体(优选地，7’、9’、11’和13’β-隐黄质酯)，其也被包括进来用于本发明。在一个优选的方面，合成制备的(全-E)β-隐黄质被用于本发明的目的。
本发明尤其涉及β-隐黄质在制造下述组合物中的用途，所述组合物用于在必需或想要体内蛋白形成增加的所有症状下，增强和提高人类和动物组织(即，肝、皮肤、肾、肌肉等)中蛋白质的合成，所述症状例如，不利的健康症状，例如肿瘤恶病质，饮食紊乱(例如，易饥症和食欲缺乏)，慢性疾病，例如，慢性心力衰竭，慢性梗阻性肺部疾病，慢性肠道疾病(例如，Crohn’s症)，慢性退化性疾病，例如，骨质疏松症、风湿性关节炎、骨关节炎；以及用于在运动及训练、康复过程中一般性地强化生长和发育，以及在衰老过程中用于预防和治疗肌肉减少(sarcopenia)。此外，本发明涉及β-隐黄质制造下述组合物的用途，所述组合物用于增强畜牧动物、宠物和竞赛型体育动物的表现以及促进它们的生长。本发明还包括β-隐黄质作为试剂在治疗下述症状中的用途，所述症状中，体内蛋白质形成的增加是必需的或想要的。
具体而言，β-隐黄质可根据本发明用于在诱导蛋白消耗的综合征和病理情况下，或在对健康个体的预防性补充中，增强和/或加强蛋白合成。其中可以根据本发明使用β-隐黄质的不利健康症状的其它例子是当病人显示出获得性免疫缺陷综合征(AIDS)最初症状时人类免疫缺陷病毒感染的状态、近来的(器官)移植以及慢性酒精滥用。β-隐黄质还可用于卧床不起的人群，以预防和治疗固定在床所诱导的肌肉损失，以及用于受到其它长期持续感染性疾病(例如，肝炎、Epstein-Barr病毒和Varicella带状疱疹感染)侵犯的人群。此外，β-隐黄质可根据本发明用于提高康复过程中的病人一般性的健康状况，例如，二度或三度烧伤之后、心肌梗塞和器官移植的病人。还已经发现，当肠中存在胆汁盐(例如，胆酸钠、甘胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐)时，根据本发明β-隐黄质促进的蛋白形成甚至更为有效。因此，在本发明的另一方面，β-隐黄质与利胆刺激物(choleretic stimulant)组合使用，或者向膳食中加入胆汁盐。用于本发明中的利胆刺激物的例子是咖啡，绿茶或红茶，药草例如，甘菊、迷迭香、薄荷、马黛茶、奶蓟草(milk thistle)、熏衣草、茴香、朝鲜蓟(作为茶或其提取物)，或者多不饱和脂肪酸(适合地，作为胶囊)。在本发明的又一方面，β-隐黄质与维生素C和/或维生素E组合使用。此外，β-隐黄质可与其它类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质(zeaxanthin)、番茄红素、虾青素、角黄素和/或柠檬黄质(apocarotenal))、染料木黄酮、白藜芦醇和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)组合用于本发明的目的。
根据本发明，对大约70kg体重的成年人而言，β-隐黄质适合以最多大约50mg/天的剂量施予，更具体地，大约100μg/天至大约30mg/天，尤其是大约1mg/天至大约10mg/天。如果作为动物饲料的补充剂，β-隐黄质可以以在最终的饲料组合物中提供大约100至大约1000ppmβ-隐黄质的量来使用。
如果共同施予利胆刺激物的话，对成年人而言，它们的量可以是使用茶时，每天1至5杯，使用提取物时，每天10mg至500mg。如果维生素E被共同施予，对成年人而言，其剂量适合为每天大约15至大约500mg维生素E。如果共同施予维生素C，对成年人而言，其剂量适合为每天大约50至大约500mg。
就本发明的目的而言，β-隐黄质适合在用于肠道应用的组合物中提供，所述组合物可以是固体或液体盖仑(氏)制剂(galenicalformulations)、膳食组合物、动物饲料或用于动物的饲料预混合物。固体盖仑(氏)制剂的例子是含有活性成分和传统盖仑(氏)载体的药片、胶囊(例如，硬或软壳的明胶胶囊)、药丸、药袋(sachet)、粉末、颗粒等。任何传统载体材料都可使用。载体材料可以是适合口服施予的有机或无机惰性载体材料。合适的载体包括，水、明胶、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、植物油等。其它添加剂，例如，调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂等也可按照可被接受的药物混合实践加入。用于与β-隐黄质共同施予的其它活性成分可以与β-隐黄质以单一组合物施予，或者可以以单独的剂量单位施予。包含β-隐黄质的膳食组合物可以是饮料、速溶饮料或食品/饲料补充剂。
如前所述，β-隐黄质可根据本发明与维生素C和/或维生素E，以及与其它类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、番茄红素、虾青素、角黄素和/或柠檬黄质)、染料木黄酮、白藜芦醇和EGCG组合使用，其可以与β-隐黄质同时施予，或者单独施予。此外，β-隐黄质可以根据本发明与传统用作为食品补充剂的其它维生素和/或矿物质组合使用，例如，B族微生物和含有Ca、Fe、P、Mg、Zn等的矿物质。典型的固体盖仑(氏)制剂每剂量单位含有大约1μg至大约50mg的β-隐黄质，以及，可选地，大约15mg(22IU)至大约500mg(750IU)的维生素E。典型的液体盖仑(氏)制剂每剂量单位可以含有大约10ng至大约50μg的β-隐黄质，以及，可选地，大约10mg(15IU)至大约50mg(75IU)的维生素E。典型的膳食组合物可以含有每g总的组合物中，大约0.1μg至大约5mg的β-隐黄质，以及，可选地，大约1.5mg(2.25IU)至大约30mg(45IU)的维生素E。
β-隐黄质促进增加的蛋白质形成的效率来自以下发现的证据，其中，施予β-隐黄质后，肌肉、肝、肾和脾中蛋白质合成涉及的基因被正调节(up-regulate)。在六周的研究中，β-隐黄质珠粒被混合进SKH-1小鼠膳食，以在饲料中提供1200ppm的β-隐黄质。此外，向每100g饲料中加入0.125g胆酸钠，以促进β-隐黄质的吸收。每只小鼠每天平均的β-隐黄质摄入量为6.5mg。六周后，对该剂量对于总体基因表达的作用加以研究。通过GeneChipDNA微阵列技术来评估β-隐黄质调节的基因表达修饰。使用TRIzol方法，按照厂商的方案，从肾、肝、皮肤和脾中提取总RNA。用10μg总RNA来进行反转录，接着进行cDNA的第二链合成。然后将cDNA转录为多cDNA拷贝，用与生物素偶联的核苷酸进行标记并进行片段化。按照GeneChipExpression Analysis Technical Manual(Affymetrix，Oxford，UK)所述，在Affymetrix Mice Genome 430A微阵列上杂交10μg经过标记和片段化的cDNA。对每种经过β-隐黄质处理的组织而言，进行五份重复，将其与未被处理的对照小鼠的六份重复相比较。漂洗和染色程序后，使用GeneChipFluidics Station，用生物素化的抗亲和素抗体来扩增信号。随后，对微阵列进行激光扫描，用GenedataExpressionist和Phylosopher软件包(Genedata，Basel，Switzerland)来分析杂交信号。主要目标是鉴定出对照和处理组中表达有明显不同的基因。通过针对每种基因的表达倍数差异，以及列出活性有超过1.20倍增加或减少的基因来进行比较。使用Welch实验来进行Genechip阵列的统计分析，以鉴定出皮肤、肾、肝和脾中对化合物有应答的基因。对DNA微阵列而言，p值＜0.01时的统计显著性是被接受的。Genedata Phylosopher软件被用于对Affymetrix探针序列进行途径和功能分类。
表1中显示了关注于蛋白合成途径中基因正调节的该研究的结果。
在核糖体代表催化蛋白合成的高效分子机制的范围内，对核糖体蛋白质基因表达的正调可与总体蛋白合成的增加相关联起来(Al-Karadaghi etal.，Prog.Biophys.Mol Biol，2000，73(2-4)167-93))。核糖体由两个亚基构成，即大亚基和小亚基。小亚基包括细菌的21种核糖体蛋白(S1-S21)，而大亚基由36种核糖体蛋白(L1-L36)构成(Wittmann HG.，Annu RevBiochem，1982，51155-83)。更新的数据表明，蛋白合成是通过核糖体与tRNA和辅助因子一致作用以“翻译”mRNA内含的遗传信息来完成的(Preiss et al.，Bioessays，2003，25(12)1200-11)。mRNA向蛋白质的翻译可被分为三个连续阶段初始化、延伸和终止。简言之，初始化阶段包括核糖体与初始因子Met-tRNA在mRNA起始密码子上的装配。蛋白合成真正开始于延伸阶段期间。当核糖体到达终止密码子时，其会通过从mRNA上释放多肽，以及可能地释放核糖体，来终止蛋白质合成(上述Preiss etal.)。
因此，核糖体可被认为是允许蛋白质合成发生的关键元件。
β-隐黄质在肌肉细胞培养物中增加了蛋白质形成C2C12细胞，来自American Type Culture Collection(ATCC，CRL-1772)。
小鼠成肌细胞系C2C12以2×105细胞/每孔的密度被接种到6cm2细胞培养皿中。在存在Dulbecco’s Minimum Essential Medium(DMEM)(含有终浓度为10％的胎牛血清、4500mg/L的葡萄糖、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素、2mM L-谷氨酰胺和1mM的丙酮酸钠)的情况下培养细胞。接种后一天，向细胞补充含有终浓度为0.25μM或1μM的β-隐黄质或载体(四氢呋喃)的新鲜培养基。β-隐黄质贮液是在四氢呋喃中制备的，对所有处理条件而言，培养基中的溶剂浓度都被保持为恒定0.14％。在含有β-隐黄质的培养基中进行的培养持续总共7个连续天。每到第二天更换培养基。每天，来自每个处理组的一个孔的细胞被刮到0.4ml裂解缓冲液中并进行超声处理，所述缓冲液由20mM Tris pH7.5、NaCl150mM、EDTA 1mM、Nonidet 1％、蛋白酶抑制剂(Roche MolecularSystems，Mannheim Germany)构成。
取10μl该溶液，用于总蛋白分析，取2μl用于总DNA分析。在10000g离心5分钟之后，将上清液用于进行可溶部分的蛋白和DNA分析。
使用BCA Protein Assay Reagent(Pierce，Rockford，USA)来测定蛋白质。Pico-green Assay(Molecular Probes，Leiden，The Netherlands)被用于分析DNA含量。
蛋白质的量被计算为μg/孔，或者相对孔中存在的细胞的量(可由DNA/孔的量来间接测定)进行计算。结果被显示于表2至4中。
表2
表3
表4
上表数据表明，0.25μM的β-隐黄质显示了大约1.4倍的总蛋白增加(表2)、可溶蛋白增加(表3)和蛋白/μg DNA的比含量增加。作用效果在1μM达到高原平台期。
因此，上述数据显示，β-隐黄质在肌肉细胞中是有效的蛋白形成增强剂。
下述实施例将对本发明进行进一步阐述。
实施例1可以使用传统技术，制备包含下述成分(wt％)的珠粒
将珠粒以高达1200mgβ-隐黄质/kg饲料的浓度直接混合进动物饲料。
实施例2配方出药片，其含有活性成分β-隐黄质 15mgdl-alpha生育酚 300mg赋形剂乳糖粉末蔗糖硬脂酸镁明胶 ad500mg对治疗慢性疾病(慢性肾衰竭、慢性心功能不全、慢性梗阻性肺部疾病、肿瘤恶病质、肌肉减少)而言，向成年人每天施予1片药片。
实施例3制备出含有如下成分的胶囊活性成分β-隐黄质 5mg
dl-alpha生育酚 100mg赋形剂明胶乳糖硬脂酸镁水稻淀粉棕榈硬脂酸甘油ad300mg对治疗慢性疾病(慢性肾衰竭、慢性心功能不全、慢性梗阻性肺部疾病、肿瘤恶病质、肌肉减少)而言，向成年人每天施予1-3粒胶囊。
实施例4用下述组分来制备婴儿配方，其中每100g含有β-隐黄质 1mg总脂肪3.7g钠19mg钾76mg总碳水化合物 7.7g蛋白质1.5g维生素和矿物质-维生素A 210IU-维生素C 8.4mg-维生素D 42IU-维生素E 1.5IU-维生素K 5.6μg-硫胺(B1) 56.3μg-核黄素(B2) 63.4μg-烟酸(B3) 704.2μg-维生素B6 42.2μg
-叶酸盐/酯、叶酸、叶酸(folacin) 11.3μg-维生素B 120.2μg-生物素 2.1μg-泛酸352.1mg-钙 54.9mg-铁 1.3mg-磷 37.3mg-碘 7μg-镁 5.6mg-锌 0.7mg-硒 2μg-铜 52.8μg-锰 10.6μg-氯 44.4mg-钾 76mg-胆碱8.4mg-肌醇4.2mg-亚油酸 605.6mg-水 94.4g上述组分混合之后，将婴儿配方冻干，成为粉末。1至12月的婴儿每天每kg体重可以获得10g婴儿配方。
实施例5250ml能量饮料，可以含有β-隐黄质5mg蛋白质 3.9g脂类 14.3g碳水化合物 71gH2O ad 250ml
维生素和矿物质-维生素E 5mg-维生素B1 1.2mg-维生素B2 1.2mg-维生素B6 1.2mg-维生素C 45mg-烟酸 9μg-钠190mg-钾180mg-钙70mg-磷120mg-镁30mg-铁1.3mg-锌1.6mg典型地，青少年和年轻人每天消耗100-500ml能量饮料。
实施例625g的能量棒可以含有β-隐黄质 2.5mg蛋白质 1g脂类 3.5g碳水化合物 16.5g纤维 3g维生素和矿物质-维生素E 5mg-维生素B1 1.2mg-维生素B2 1.2mg-维生素B6 1.2mg-维生素C 45mg
-烟酸11mg-钠 190mg-钾 180mg-氯 210mg-钙 70mg-磷 120mg-镁 30mg-铁 1.3mg-锌 1.6mg典型地，青少年和年轻人每天消耗1-3条能量棒。
实施例7250ml运动饮料可以含有β-隐黄质10mg蛋白质 3.9g脂类 14.3g碳水化合物 71gH2O ad 250 ml维生素和矿物质-维生素E 5mg-维生素B11.2mg-维生素B21.2mg-维生素B61.2mg-维生素C 45mg-烟酸9mg-钠 190mg-钾 180mg-钙 70mg-磷 120mg
-镁 30mg-铁 1.3mg-锌 1.6mg典型地，体重90kg的运动员或健美运动员每天消耗250至500ml运动饮料。该饮料还适于老年人，以预防或减轻肌肉减少。
实施例8用于禽类的饲料预混合物每kg含有维生素A(RovimixA 500) 2g维生素D3(RovimixD3500)1g维生素E(RovimixE 50 Ads) 4g维生素B12(B121％) 0.1g维生素B3(RovimixB2 80-SD) 0.5g烟酸(RovimixNiacin)0.1g泛酸钙(RovimixCalpan) 0.05g叶酸(RovimixFolic 80 SD) 2mg维生素B6(RovimixB6)8mg维生素B1(RovimixB1)4mg维生素C 0.2g类胡萝卜素(CarophyllRed) 2gβ-隐黄质珠粒配方5％ 2g(见实施例1)胆碱氯50％ 150g氧化锰(IV) 30g氧化锌 6g单水合硫酸亚铁(II) 10g氧化铜(II) 1g硫酸钴(II) 0.1g载体
(石灰石、水稻壳、小麦粗粉)792g总计 1000g向每gk饲料中补充1至30g饲料预混合物。
权利要求
1.β-隐黄质在制造下述组合物中的用途，所述组合物用于在人类和动物中促进增加的蛋白形成和/或预防蛋白损失。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述组合物用于促进增加的蛋白形成和/或预防由不利的健康症状导致的蛋白损失。
3.如权利要求2所述的用途，其中，所述不利的健康症状是慢性疾病、肿瘤恶病质或饮食紊乱。
4.如权利要求2所述的用途，其中，所述不利的健康症状是病毒感染。
5.如权利要求2所述的用途，其中，所述不利的健康症状是二度或三度烧伤之后、心肌梗塞之后或器官移植之后的状况。
6.如权利要求2所述的用途，其中，所述不利的健康症状是骨骼损伤或手术后固定在床的状况。
7.如权利要求1所述的用途，其中，所述组合物用于强化生长和发育。
8.如权利要求1所述的用途，其中，所述组合物用于在运动和训练活动中促进增加的蛋白质形成。
9.如权利要求1所述的用途，其中，所述组合物用于在衰老期间促进增加的蛋白形成和/或预防及治疗肌肉减少。
10.如权利要求1所述的用途，其中，所述组合物用于促进畜牧动物和宠物的生长，以及用于提高竞赛型体育动物的表现。
11.如权利要求1-10中任意一项所述的用途，其中所述组合物是盖仑组合物。
12.如权利要求1-10中任意一项所述的用途，其中所述组合物是膳食组合物。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述膳食组合物是饲料或饲料预混合物。
14.如权利要求1-13中任意一项所述的用途，其中所述β-隐黄质是(全-E)β-隐黄质。
15.如权利要求11所述的用途，其中，所述组合物中，对固体组合物的每个计量单位而言，β-隐黄质的含量最多大约50mg；对每ml液体组合物而言，β-隐黄质的含量最多大约50μg。
16.如权利要求12所述的用途，其中，所述组合物中β-隐黄质的含量为每g总的组合物中最多大约5mg。
17.如权利要求1-16中任意一项所述的用途，其中，所述组合物额外含有维生素E和维生素C中的至少一种。
18.一种方法，用于在人类和动物中促进增加的蛋白形成和/或预防蛋白损失，所述方法包括向所述人类或动物施予有效量的β-隐黄质。
19.如权利要求18所述的方法，用于改善不利的健康症状。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述不利的健康症状是慢性疾病、肿瘤恶病质或饮食紊乱。
21.如权利要求19所述的方法，其中，所述不利的健康症状是病毒感染。
22.如权利要求19所述的方法，其中，所述不利的健康症状是二度或三度烧伤之后、心肌梗塞之后或器官移植之后的状况。
23.如权利要求19所述的用途，其中，所述不利的健康症状是骨骼损伤或手术后固定在床的状况。
24.如权利要求18所述的方法，其中所述增加的蛋白形成用于强化生长和发育。
25.如权利要求18所述的方法，其用于在运动和训练活动中促进增加的蛋白质形成。
26.如权利要求18所述的方法，其用于在衰老期间促进增加的蛋白形成和/或预防蛋白损失。
27.如权利要求18所述的方法，其中，所述增加的蛋白形成用于促进畜牧动物和宠物的生长，以及用于提高竞赛型体育动物的表现。
28.如权利要求18-27中任意一项所述的方法，其中，最多大约50mg的β-隐黄质，更具体地，大约100μg/天至大约30mg/天，尤其是大约1mg/天至大约10mg/天的β-隐黄质被施予大约70kg体重的成年人。
29.如权利要求18-28中任意一项所述的方法，其中，胆汁盐或利胆刺激物被共同施予。
全文摘要
β－隐黄质及其酯可用于在人类和动物中促进增加的蛋白形成和/或预防蛋白损失。
文档编号A23K1/16GK1953669SQ200580015831
公开日2007年4月25日 申请日期2005年5月10日 优先权日2004年5月18日
发明者安妮·埃辛格, 瑞吉纳·古拉尔奇克, 卡林·威兹, 艾德里安·维斯 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司