专利名称：柱花草9－顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及柱花草9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶及其编码基因与应用。
背景技术：
植物的生长发育受到植物激素的调节作用。环境中的非生物胁迫，例如干旱、盐碱、冷害和热害等影响植物的生长和发育，造成农作物的减产，也影响果树、花卉、园艺观赏植物的正常生长，培育耐逆的植物品种是种植业的主要目标之一。脱落酸(ABA)是调控植物生长发育的一种激素，对植物胚胎发育、种子休眠、果实成熟和抗逆性等生理过程起着重要的调控作用。ABA通过诱导气孔的关闭降低蒸腾速率，减少植物在逆境条件下的水分丧失。ABA参与信号转导系统，调控抗逆相关基因的表达，提高抗氧化酶活性和渗透调节物质含量，减轻逆境引起的伤害。ABA在农业生产中具有重要的应用价值。
9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是高等植物ABA生物合成途径中的关键酶，催化类胡萝卜素(C40)9-顺式紫黄质或9-顺式新黄质发生氧化裂解，生成ABA的前体物质——黄质醛，黄质醛在细胞质中经过两步催化反应生成ABA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶。
本发明的另一个目的是提供编码上述9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因SgNCED1。
本发明的另一个目的是提供含有上述基因SgNCED1的重组表达载体。
本发明的另一个目的是提供上述重组表达载体转化的重组微生物。
本发明的另一个目的是提供来源于上述核苷酸序列的核酸分子探针。
本发明的进一步目的是提供上述基因SgNCED1在提供植物耐逆性中的应用。
本发明的基因SgNCED1来源于柱花草(Stylosanthes guianensis)，该基因的核苷酸序列是以下核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO12)与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
基因SgNCED1编码的9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白序列，是序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列或与序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少95％的同源性并具有基本相同功能的氨基酸序列。
本发明的SgNCED1基因进行同源基因的克隆；用SgNCED1基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织或细胞；将转化的植物组织或细胞培育成植株。
本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常是PCR扩增产物，其中PCR扩增引物对应于SgNCED1基因序列，可位于该编码序列的两侧或中间。该探针可用于检测样品中是否存在与SgNCED1基因同源的核苷酸序列。
此外，根据本发明的SgNCED1核苷酸序列及其编码的氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质同源性的基础上，筛选NCED同源基因或同源蛋白。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的SgNCED1基因导入植物，可以获得耐逆性提高的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成性启动子或组织特异性启动子或诱导型启动子；为了便于对转基因植物进行筛选及鉴定，可以对所用载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。从转基因植物的安全性考虑，可以不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。携带有本发明SgNCED1的表达载体可通过常规生物技术方法导入植物细胞或器官，被转化的植物可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，例如烟草、大豆、苜蓿、柱花草、杨树、花生、棉花、番茄、黄瓜、草坪草、玉米、小麦、水稻等。
本发明的有益效果本发明从柱花草(Stylosanthes guianensis)中克隆了9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶的编码基因，命名为SgNCED1。该基因表达受干旱、高盐和低温等非生物胁迫的诱导。非生物胁迫是限制农作物和其他经济作物产量的重要因素之一，ABA可以提高植物的耐逆性，NCED是高等植物ABA合成步骤中的关键酶。将本发明的基因应用于植物逆境基因工程，可提高植物的耐逆性，具有良好的应用前景。
图1为SgNCED1的Southern杂交结果图；图2为SgNCED1受低温逆境诱导的情况；图3为SgNCED1受脱水逆境诱导的情况；图4为SgNCED1受高盐逆境诱导的情况；图5为对转基因植株的耐盐性和耐旱性鉴定比较图。
其中，图5中，A为0.9％NaCl耐盐性结果比较图，B为10％PEG耐旱性结果比较图。
具体实施例方式
实施例1 SgNCED1的克隆根据GenBank中检索出的菜豆(Phasealus vugaris)、豇豆(Vignaunguiculata)和豌豆(Pisum sativum)的NCED同源序列，设计简并引物ZG33 5’GCCGG(G/T)CACCACTTCTTCGACGG 3’ZG34 5’CTCTTCAAACTCTC(C/G/A)TCGCAATC 3’取脱水的柱花草叶片提取总RNA，用Promega公司的M-MLV反转录酶合成单链cDNA第一链作为模板，以ZG33和ZG34为引物，用PCR的方法扩增出约800bp的片段，将该片段克隆到T载体，获得SgNCED1的部分编码序列。
为了获得全长cDNA，根据3’-RACE的原理，依此序列设计3’RACE引物3’端上游引物ZG77 5’CCAGAGTGCTTCTGCTTCCATCT 3’3’端下游引物ZG60 5’CTGATCTAGAACGCGTGGATCC 3’进行PCR扩增，获得约1100bp的片段，克隆到T载体，获得SgNCED1的3’端，序列，含有polyA尾巴。
利用大连TaKaRa生产的5’-RACE试剂盒和已知的SgNCED1部分序列设计相关引物ZG45 5’P-CGTAACGGCCAAC 3’ZG42 5’GCCACGCCCATTCCGTTTTTACCGT 3’
ZG43 5’TCTTGGCGATGTCCGAAGATG 3’ZG36 5’CGGAGTGGCCGTGGAGTTCTCCGA 3’ZG44 5’TCACGTGCGCGTCACGCCAAG 3’按照5’-RACE试剂盒说明书的方法，扩增出了约700bp的片段，克隆到T载体，获得了5’端序列。
用Omiga2.0分析软件将SgNCED1的部分编码序列、3’端和5’端的序列拼接起来，得到cDNA全长序列，为序列表中的SEQ ID NO1，由2241个碱基组成，包括5’端非编码区(5’UTR)60bp，开放阅读框架(ORF)1809bp和3’端非编码区(3’UTR)372bp，最后以polyA结尾。其中开放阅读框位于第61到第1869位，共1809个碱基，编码序列表中SEQ ID NO2蛋白质。
实施例2 SgNCED1基因在柱花草基因组中的拷贝数分析应用Southern杂交技术分析了SgNCED1基因在柱花草基因组中的拷贝数。用CTAB法提取柱花草DNA，分别用以下限制性内切酶EcoR I、Sac I和EcoR V消化基因组DNA，电泳，转膜。SgNCED1的部分编码序列(764bp)作探针模板，用TaKaRa的探针标记试剂盒，用[α-32P]dCTP同位素标记探针，进行Southern杂交，结果如图1所示。在SgNCED1编码区内没有EcoR I、EcoR V的酶切位点，杂交结果只有一条带；在SgNCED1编码区内有一个Sac I酶切位点，杂交结果有两条带。说明SgNCED1在柱花草基因组中以单拷贝的形式存在。
实施例3 SgNCED1受逆境诱导的表达情况将苗龄8周的柱花草叶片剪下，置于超净工作台内吹风，使叶片脱水，进行脱水处理；将苗龄8周的柱花草约10厘米长的顶端剪下，立即插于盛有3％NaCl溶液的50ml三角瓶内培养，进行盐胁迫处理；将苗龄8周的柱花草置于光照14h、黑暗10h的人工气候箱内在7℃下培养3d，进行低温处理。
从叶片提取总RNA，用常规Northern杂交方法分析SgNCED基因的表达，并用酶联免疫试剂盒测定ABA含量，结果如图2。从图2中看出，SgNCED1的表达受低温、脱水和高盐胁迫的诱导。SgNCED1在低温胁迫6个小时开始表达，在低温胁迫第二天，表达量最高，常温恢复一天以后，停止表达；SgNCED1在脱水处理0.5小时开始表达，在处理5个小时达到最高峰；在高盐胁迫3个小时开始表达，在7个小时达到最高峰。ABA含量的变化与SgNCED1的表达一致。表明SgNCED1能够响应逆境的诱导。
实施例4 SgNCED1植物表达载体的构建和功能检验SgNCED1植物表达载体的构建按常规方法进行。将用Xba I和Sma I进行双酶切的SgNCED1和双元表达载体pBI121用T4DNA连接酶进行连接，热击转化大肠杆菌DH10B，筛选出阳性重组子，获得SgNCED1基因插入pBI121多克隆位点的重组表达载体，命名为pBI-SgNCED1。用电击法将pBI-SgNCED1转化到农杆菌EHA105。
用常规的农杆菌介导法，将带有重组质粒pBI-SgNCED1的农杆菌EHA105浸染烟草叶片。经过共培养和抗生素筛选得到抗卡那霉素的植株，经过PCR检验，表明SgNCED1基因已整合到烟草中。
将在MS培养基(含100mg/l卡那霉素)上培养2-4周、长出3-6片真叶的转基因烟草小苗和野生型对照烟草分别移栽到含0.9％NaCl的MS培养基，或者移栽到含10％PEG6000的MS培养基上继续培养。培养3-4周后，转基因烟草生长发育良好，而野生型植株逐渐死亡，如图3所示。证明表达SgNCED1基因的转基因植株提高了耐盐性和耐旱性。
SEQUENCE LISTING<110>华南农业大学<120>柱花草9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶及其编码基因与应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2241<212>DNA<213>柱花草(Stylosanthes guianensis)<220>
<221>CDS<222>(61)..(1866)<400>1tctcatacac agtaatagta acctcttcac tattcacact ttcaaaatag agaaacaacc 60atg gca gca act tca aac aca tgg atc aat acc aaa ctt cca tca tca108Met Ala Ala Thr Ser Asn Thr Trp Ile Asn Thr Lys Leu Pro Ser Ser1 5 10 15tgc tcc tct tta aaa ggt gca tca tgt tca cct caa aca cca tcc tca156Cys Ser Ser Leu Lys Gly Ala Ser Cys Ser Pro Gln Thr Pro Ser Ser20 25 30ttc act atg agg agt agt aac aag agg agg acc aat tgc aac aca atc204Phe Thr Met Arg Ser Ser Asn Lys Arg Arg Thr Asn Cys Asn Thr Ile35 40 45aaa tgc tcc ctc caa aca ctc cac ttc cca aaa cag tta caa cca act252Lys Cys Ser Leu Gln Thr Leu His Phe Pro Lys Gln Leu Gln Pro Thr50 55 60acc acc acc aca aca aca aca aaa cca tca aca aaa tca ata cca acc300Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Lys Pro Ser Thr Lys Ser Ile Pro Thr65 70 75 80aaa gaa aat aaa acc gca aat gac tgg aac ctt ata caa aag gcg gca348Lys Glu Asn Lys Thr Ala Asn Asp Trp Asn Leu Ile Gln Lys Ala Ala85 90 95tcc atg gca ata gac ttc gcc gaa tcc gcc tta gcc tca cac gag cgc396Ser Met Ala Ile Asp Phe Ala Glu Ser Ala Leu Ala Ser His Glu Arg100 105 110aaa cac ccg ctc cca aag act gcc gat ccc cgc gtt cag atc gct gga444Lys His Pro Leu Pro Lys Thr Ala Asp Pro Arg Val Gln Ile Ala Gly115 120 125aac ttc gcg ccg gtg ccg gag cat ccc gtt act cag aac ctc cca atc492Asn Phe Ala Pro Val Pro Glu His Pro Val Thr Gln Asn Leu Pro Ile130 135 140gcc gga aaa ctc ccg gaa tgc att gac gga gtc tat gtc cgc aac ggc540Ala Gly Lys Leu Pro Glu Cys Ile Asp Gly Val Tyr Val Arg Asn Gly145 150 155 160gcc aac ccg atg tac gag cca ctc gcc gga cac cac ctc ttc gac ggc588Ala Asn Pro Met Tyr Glu Pro Leu Ala Gly His His Leu Phe Asp Gly165 170 175gac ggc atg gtc cac gcc ttg aaa ttc cac aac ggc tcc gcc agc tac636Asp Gly Met Val His Ala Leu Lys Phe His Asn Gly Ser Ala Ser Tyr180 185 190tcc tgc cgg ttc acc gaa aca aac cgc ctc gtc caa gag aaa tcc ctc684Ser Cys Arg Phe Thr Glu Thr Asn Arg Leu Val Gln Glu Lys Ser Leu
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权利要求
1.一种柱花草9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶，其特征是其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或是与SEQ ID NO2具有至少95％的同源性序列，或是将SEQ ID NO2经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的。
2.根据权利要求1所述的柱花草9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶，其特征是其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.编码权利要求1所述柱花草9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因SgNCED1的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述基因SgNCED1的核苷酸序列，如SEQ ID NO1所示。
5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体。
6.权利要求5所述重组载体转化的转基因植物。
7.一种核酸分子探针，其来源于权利要求3或4所述的核苷酸序列。
8.权利要求3或4所述基因在提高植物耐逆性中的应用。
9.根据权利要求7所述的基因，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体涉及柱花草9－顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶及其编码基因与应用。本发明从柱花草(Stylosanthes guianensis)中克隆了9－顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶的编码基因，命名为SgNCED1。该基因表达受干旱、高盐和低温等非生物胁迫的诱导。非生物胁迫是限制农作物和其他经济作物产量的重要因素之一，ABA可以提高植物的耐逆性，NCED是高等植物ABA合成步骤中的关键酶。将本发明的基因应用于植物逆境基因工程，可提高植物的耐逆性，具有良好的应用前景。
文档编号A01H5/00GK1844377SQ20061003491
公开日2006年10月11日 申请日期2006年4月11日 优先权日2006年4月11日
发明者郭振飞, 杨锦芬 申请人:华南农业大学