芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子复合制剂、其制备方法及应用的制作方法

专利名称：芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子复合制剂、其制备方法及应用的制作方法
芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子复合制剂、其制备方法及应用技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其是农业生物技术领域。具体而言，本申请涉及芽孢 杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子复合制剂、其制备方法及应用。
背景技术：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温性的好氧产芽孢的杆状细菌，其 生理特征丰富多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害， 不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌 不仅可以在土壤、植物根际、体表等外界环境中广泛存在，同时还是植物体内常见的植物内 生细菌，尤其是在植物的根、茎部。目前该菌己经在水稻、辣椒、棉花、小麦、黄瓜、大豆、玉米 等农作物上显现出很好的病害防治效果。枯草芽孢杆菌最突出的特征是生长快、营养简单， 能产生耐热抗逆的芽孢，这不仅有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖 与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生 物，具有广阔的应用前景。
枯草芽孢杆菌通过定殖在植物根际、体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、 分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的 目的。主要防治对象大部分为丝状真菌所引起的植物病害，如水稻纹枯病(Magonospora curtisii)、番爺叶霉病(Cladosporium fulvum)、大豆根腐病(Fusarium graminerarum)、 苹果霉心病(Alternaria alternata)、棉花立枯病(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病 (Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)等。枯草芽孢杆菌生防机制主要包括竞争作用、 拮抗作用和诱导抗性作用3个方面。另外，枯草芽孢杆菌产生的具有生防活性的抗菌物质， 包括脂肽类、肽类、蛋白类、磷脂类、多烯类、氨基酸类和核酸类等多种化合物，它们对真菌、 细菌、病毒等具有抑制作用。
尽管枯草芽孢杆菌作为生物杀菌剂在植物病害的生物防治中取得了一定的成就， 但从整体上看还存在不少问题(R. campbell, 1993)。
首先，作为生物杀菌剂，枯草芽孢杆菌在田间效果表现并不稳定，这可能由于通常 采用室内保存多代的菌株，与野生菌株活性有较大差异，且室内盆栽试验与田间复杂的微 生态环境迥然不同，造成室内抑菌圈测定结果与田间结果差异较大。其次，微生物制剂其毒 性和安全性一般认为好与化学药剂，倾向于无毒和无残留，但是一些微生物制剂也可能引 起病原菌抗性，特别是那些以抗生素类分泌物抑制病原菌的菌株。欧洲己将产抗生素杆菌 肽锌的枯草芽孢杆菌畜用制剂列入禁用名单，理由是容易产生耐药性和抗生素残留。我国 对微生物农药安全性的研究还很少，多数没有引起足够的重视。最后，作为微生物农药，其 防治成本一般要高于化学药剂，而且主要为保护剂，在植物发病后使用，效果较差，有些甚 至无效，这是许多微生物农药都存在的弊病。
为解决上述存在的问题，增强生防菌的生防效果，并改善它们对环境条件的适应3性等，国内外许多实验室已在利用细胞工程和基因工程技术进行生防微生物的遗传改良， 构建新型高效的生防菌(王金生，200 。如陈中义等(1999)通过质粒载体将Bt基因导入 水稻生防芽孢杆菌B916，室内试验表明重组菌株具有良好的杀虫防病作用和很好的遗传稳 定性。但由于不少拮抗基因特别是抗生素合成基因均由结构复杂的基因簇构成，遗传操作 比较困难。因此，有关技术还需进一步研究。
木霉用于防治植物病害的历史已有70多年，其生防效果已得到公认，是全世界应 用较为广泛的生防菌。木霉属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，粘孢菌类，是一类 普遍存在于土壤中的真菌，是土壤微生物的重要群落，其可寄生于植物残体及动物粪便上， 从植物根围、叶片及种子、球茎表面也经常可以分离到，木霉能够寄生于多种土传植物的病 原菌上。八十年代以来，随着分子生物学的快速发展，木霉的研究主要集中在如何提高其生 物防效方面，如通过加强几丁质酶、葡聚糖酶基因的表达、种间融合等手段。木霉菌PDA培 养菌落初为棉絮状或致密丛束状，颜色为白色至灰白色，无固定形状。当分生孢子成熟后， 菌落自中央到边缘，渐渐变为不同程度的绿色，极少数为白色粉状。分生孢子梗从菌丝的侧 枝生出，直立分枝，小枝常对生，顶端不膨大，上生分生孢子团。分生孢子球形，浅色或无色。 大部分木霉对营养的需求并不严格，它们可在各种碳源和氮源下生长，同时可转化和降解 一些有害或持久有害的环境污染物；可直接利用各种单糖、单糖的衍生物、有机酸类；有显 著的降解各种多糖(纤维素、半纤维素)和相关的多聚糖(几丁质)；还可转化和降解一些 农药，如马拉硫磷、茅草枯、五氯硝基苯等。木霉可利用复杂和简单的氮，水解酪蛋白氨基 酸混合液、天门冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸均能很好利用，在高氮条件下有利于木霉产生一些 酶，如纤维素酶、乳糖酶等。木霉是需氧菌，适合的氧压有利于菌丝的生长和孢子产生；最佳 PH为4. 0-6. 5 ；生长温度因种而不同，大多数在25°C左右生长十分迅速，并自我调节环境的 PH值，使环境适应其生长条件。
木霉菌的拮抗作用范围具有广谱性，相关研究显示，木霉菌至少对18个属四种病 原真菌有拮抗作用。木霉菌能寄生的植物病原菌即拮抗对象包括丝核菌属(Miizotonia)、 /Jn (Sclerotium) ,^M Μ. M M (Sclerotinia) > ix if M (Helminth osporium)、H 刀菌属(Fusarium)、毛盘孢属(Colletotrichum、轮枝孢属(Verticillium)、黑星菌属 (Venturia)、内座壳属(Endothia)、腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophthora)、间座壳属 (Diaporthe)和黑星孢属(Fusicladium)等等。
目前市场上的木霉制剂均是分生孢子制剂和菌丝型制剂，多是由固体发酵而来。 固态发酵不仅是目前真菌培养通过气生菌丝获得大量分生孢子的最好方法，而且其特有的 优势已使其被广泛应用和研究。另外，固体发酵产生的分生孢子比液体发酵产生的分生孢 子质量好，耐干燥力强，存活时间长。而且在田间应用时，固态发酵产物可直接施用，无需制 成制剂，后处理简单，成本低。但其生产和应用规模不大，究其原因，最关键的难题没有解 决即产品的货架期短。一般以分生孢子为有效成分的制剂，保证活菌含量的时间不会超过 3个月，后期所接制剂中的木霉存活量难以达到要求，其防效的稳定性没有得到有效保证， 在植物病害防治中目前尚不能完全取代化学防治等其它治理措施。发明内容
为解决上述问题，本发明提供了以下技术方案。
本发明第一方面提供了一种用于防治植物病害的复合制剂，所述复合制剂包含芽 孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子。
在一个较佳的实施方案中，所述复合制剂是可湿性粉剂，所述复合制剂包含载体 和润湿分散剂，所述载体选自白碳黑或硅藻土，所述润湿分散剂选自烷基萘磺酸盐。在一 个更佳的实施方案中，所述载体的含量为5-30% (W/W)，所述润湿分散剂的含量为0. 5-5% (W/W)，以发酵液的重量为基准(以可湿性粉剂干燥之前发酵液的重量为基准)。在另一个 较佳的实施方案中，所述复合制剂中所述芽孢杆菌芽胞的含量为IO8-IOltl个细胞/克(制 剂)，所述木霉菌厚垣孢子的含量为IO8-IO9个活孢子/克(制剂)。
本发明另一方面提供了 一种制备上述复合制剂的方法，该方法包括以下步骤
(1)提供含芽孢杆菌芽胞的发酵液以及含木霉菌厚垣孢子的发酵液；
(2)将含木霉菌厚垣孢子的发酵液勻浆，然后与含芽孢杆菌芽胞的发酵液混合，得 到所述复合制剂。
在一个较佳的实施方案中，所述步骤(1)中的含木霉菌厚垣孢子的发酵液用以下 方法获得
在发酵培养基中，温度25 33°C、种子接种量5 10%、种子浓度IO5-IO6个/ mL、通气比1 2至2 1，罐压0.03-0. 05MPa下，发酵84-96小时，获得含木霉菌厚垣 孢子的发酵液，其中所述发酵培养基的组成是麸皮0.4-0.6%，(NH4)2SO4 0. 1-0.3%, KH2PO4O. 1-0. 2%, CaCO3 0. 1-0. 2%,葡萄糖 1-3%，0. 2-0. 5% 的大豆油，ρΗ5· 5-6. 0。
在另一较佳的实施方案中，所述复合制剂是可湿性粉剂，它是通过对步骤(2)所 得的复合制剂进一步干燥制得的，且在所述步骤O)中还包括混合入载体和润湿分散剂的 步骤，所述载体选自白碳黑粉或硅藻土，所述润湿分散剂选自烷基萘磺酸盐。在更佳的实施 方案中，所述载体的含量为5-30% (W/W)，所述润湿分散剂的含量为0. 5-5% (W/W)，以发酵 液的重量为基准。
本发明另一方面涉及本发明上述复合制剂在防治植物病害中的应用。在较佳的实 施方案中，所述植物病害选自西瓜枯萎病和蔓枯病。
本发明的复合制剂可用于防治多种植物土传病害，同时，该菌剂能够促进植物生 长，提高肥料利用率，诱导植物产生抗逆境和抗病害的能力。通过该发明生产出的厚垣孢子 制剂比用传统方法生产的分生孢子制剂具有更强的生活力和抗逆能力，作用功能更多，更 适合于生产应用。
具体实施方式
本发明第一方面提供了一种用于防治植物病害的复合制剂，所述复合制剂包含芽 孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子。所述芽孢杆菌宜为枯草芽孢杆菌。
在一个优选的实施方案中，所述复合制剂中所述芽孢杆菌芽胞的含量为IO8-IOki 个细胞/克制剂，所述木霉菌厚垣孢子的含量为IO8-IOki个活孢子/克制剂。
本发明的复合制剂可以采用本领域技术人员熟知的各类农药剂型，其包括但不局 限于粉齐 、可湿性粉齐 、乳油、颗粒齐 、胶悬齐 、水溶齐 、气雾剂、片齐 、烟齐 、熏蒸齐 、油雾 剂、缓释剂、微胶囊剂、悬浮乳剂、固体乳油、微乳剂和可流动粉剂等，其中优选可湿性粉剂、 微胶囊制剂、悬浮乳剂、固体乳油、微乳剂和可流动粉剂。由于可湿性粉剂和微胶囊剂使用方便安全、持续性强，有利于生物农药的长效作用，且使用的助剂无害，不含有有机溶剂，对 环境友好，所以是最为优选的。
在本发明的复合制剂(如可湿性粉剂)中，还可包含其它载体和助剂等。在一个优 选的实施方案中，本发明的复合制剂是可湿性粉剂，该可湿性粉剂包含载体和润湿分散剂。 惰性的载体常用于加工粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂等固体剂型，其作用是稀释有效成分便于 加工，改善理化性状便于使用。作为制剂载体的惰性材料会在一定程度上影响制剂中孢子 的稳定性。制剂中孢子的存活表现为一定水平的新陈代谢。即使在特定贮存条件下代谢活 动非常微弱，但积累起来的代谢副产物会对孢子自身产生抑制作用。
在本发明中，优选的惰性载体是所述载体选自白碳黑粉或硅藻土。
润湿分散剂能降低水的表面张力使有效成分很快被水润湿的物质。加工可湿性粉 剂、悬浮剂、干悬浮剂、水分散性粒剂等，兑水配成悬浮液喷洒用的剂型时添加润湿剂，使不 溶于水的药粒表面很快被润湿而分散悬浮于水中。药液喷洒到靶体表面上易于展布，扩大 覆盖面积。常用的润湿剂有皂角、茶枯、木质素磺酸盐、烷基苯磺酸盐、拉开粉、多种非离子 型表面活性剂等。在本发明中，优选的润湿分散剂为烷基萘磺酸盐。
所述载体和润湿分散剂的含量很容易由本领域技术人员根据有限实验来确定。 在一个较佳的实施方案中，所述载体的含量为5-30% (W/W)，所述润湿分散剂的含量为 0. 5-5% (W/W)，以发酵液的重量为基准。
另外，本发明的复合制剂内还可添加其它具有活性组分，这可由本领域技术人员 根据具体目的通过常规试验来进行选择和确定。
制备方法
技术领域：
本发明另一方面提供了 一种制备本发明复合制剂的方法，该方法包括以下步骤
(1)提供含芽孢杆菌芽胞的发酵液以及含木霉菌厚垣孢子的发酵液；
(2)将含木霉菌厚垣孢子的发酵液勻浆，然后与含芽孢杆菌芽胞的发酵液混合，得 到所述复合制剂。
含芽孢杆菌芽胞的发酵液以及含木霉菌厚垣孢子的发酵液的用量(或其混合比 例)可由本领域技术人员根据具体情况通过常规试验来确定，通常较佳的是希望复合制剂 中所述芽孢杆菌芽胞的含量为IO8-IOltl个细胞/克，所述木霉菌厚垣孢子的含量为IO8-IOki 个活孢子/克。在所述步骤( 中，所述勻浆步骤的目的是使菌丝体充分破碎，具体可采用 本领域技术人员熟知的各种机械破碎方法。
在一个优选的实施方案中，所述复合制剂是可湿性粉剂。为了便于长期贮存，可将 发酵液与载体、润湿分散剂或其它助剂按照一定的比例混合后得到液固混合物，然后采用 诸如压力式喷雾、离心式喷雾等方式进行干燥，从而制得所述可湿性粉剂。因此，在该实施 方案中，还包括在所述混合液中混合入载体和润湿分散剂的步骤。所述载体和润湿分散剂 的添加次序没有特别的限制，它们之一或两者可以先部分或全部加入含芽孢杆菌芽胞的发 酵液后再与含木霉菌厚垣孢子的发酵液勻浆后的勻浆液混合得到混合液，也可以先部分或 全部加入与含木霉菌厚垣孢子的发酵液勻浆后的勻浆液后再与含芽孢杆菌芽胞的发酵液 混合得到混合液，或者可以在将含木霉菌厚垣孢子的发酵液勻浆后的勻浆液与含芽孢杆菌 芽胞的发酵液混合之后再加入部分或全部载体和/或润湿分散剂。在一个优选的实施方案 中，所述载体宜选自白碳黑粉或硅藻土，所述润湿分散剂宜选自烷基萘磺酸盐。在更优选的实施方案中，所述载体的添加量，以发酵液总重量(即步骤O)的发酵液混合物的重量) 计，5-30% (优选10-20%)的载体以及0.5-5% (优选)的润湿分散剂。
如何提高已有制剂中的孢子的耐受能力也是解决现有技术中存在的问题的重要 方面。木霉的厚垣孢子是木霉抵抗不良环境而休眠的生存结构。厚垣孢子，一般是在不良 条件下，菌丝细胞内的原生质收缩，细胞壁加厚而形成。在无隔菌丝中，菌丝的一部分集中 储存养料，同时产生厚壁，两端形成封闭的隔膜而与菌丝其它细胞切断，形成厚垣孢子；在 有隔菌丝的较老菌丝部位往往可形成厚垣孢子。厚垣孢子一旦遇到适宜的环境条件便萌发 产生菌丝。所以，利用厚垣孢子为主体的生防制剂就可能具有耐贮藏和货架寿命长长等优 点，能满足作为生物农药的要求。然而，由于厚垣孢子对人工发酵培养要求条件比较苛刻， 所以寻找适宜的发酵培养条件以求得到高生物量的厚垣孢子成为亟待解决的问题。
在本发明中，还提供了一种获得木霉菌厚垣孢子或含木霉菌厚垣孢子发酵液的方 法，该方法包括在发酵培养基中，温度25 33°C、种子接种量5 10%、种子浓度IO5-IO6 个/mL、通气比1 2至2 1，罐压0.03-0. 05MPa下，对木霉菌进行液体发酵84-96小时， 从而获得富含木霉菌厚垣孢子的发酵液。所用的发酵培养基的组成是麸皮0.4-0.6%， (NH4)2SO4 0. 1-0. 3%, KH2PO4 0. 1-0. 2%, CaCO3 0. 1-0. 2%，葡萄糖 1-3%，0· 2-0. 5%的大 豆油，pH5. 5-6. O0
在更优选的实施方案中，该方法包括在发酵培养基中，温度^-30°C、种子接种量 6-9%、种子浓度IO5-IO6个/mL、通气比1 2至2 1，罐压0. 03-0. 05MPa下，对木霉菌 进行液体发酵96小时，从而获得富含木霉菌厚垣孢子的发酵液。所用的发酵培养基的组成 是麸皮0. 5%，(NH4)2SO4 0. 2%,KH2PO4 0.1%,CaCO3 0. 1 %，葡萄糖 2%，0. 2-0. 3%的大豆 油，pH5. 5-6. O0
防治植物病害的应用
本发明提供的复合制剂可以用于有效地防治各种植物病害。在一个较佳的实 施方案中，本发明的复合制剂可以用于有效地防治包括丝核菌属(Miizocionia)、壳球孢 属(Macrophomina)、键刀菌属(Fusarium)、核盘菌属(sclerotium)、腐霉属(Phythium)、 ^βΜ (Phytophthora)、/]、胃(Sclerotium)、 3 M (Helminth osporium)、^ i 孢属(Colletotrichum、轮枝孢属(Verticillium)、黑星菌属(Venturia)、内座壳属 (Endothia)、间座壳属(Diaporthe)和黑星孢属(Fusicladium)等引起的植物病害或土传 植物病害。另外，本发明的复合制剂还可以防治草莓等植物的白粉病和灰霉病等，还可以控 制瓜、果的采后各种腐烂病。
更具体地说，本发明的复合制剂可以用于防治以下植物病害水稻纹枯病、稻曲 病；三七，烟草，花卉，小麦，白菜等的土传病害；白粉病，灰斑病，炭疽病等疫病；小麦纹枯 病；稻瘟病，甘蓝黑斑病；黄瓜白粉病，草莓白粉病和灰霉病；猝倒病(如番茄，黄瓜，茄子， 青椒，西瓜，香瓜，甜瓜)，根腐病，立枯病，枯萎病等病害。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。本发明的所有技术方案(包括较佳的、更较的或最佳的技术 方案)均可任意组合而形成新的技术方案。所有这些技术方案均视为在本申请的文字记载 范围内。除非另有描述，本发明的实施将采用本领域技术人员所知道的常规技术。或者，可 按照试剂生产商所提供的说明书进行。
实施例1 木霉T4的500L罐液体发酵产厚垣孢子的研究
本实施例对木霉T4在500L发酵罐中的厚垣孢子产生进行了研究。所用菌株为绿 色木霉(T. viride) T4，从植物根际土壤中分离获得，并可从华东理工大学生物反应器工程 国家重点实验室购买，另可参见文献(夏斯琴，王伟，化学与生物工程，“绿色木霉T4的固体 发酵工艺及其制剂稳定性的研究”，2008年，Vol. 25，No. 12，52-56页)。
在发酵培养基中，温度观_301、种子接种量6-9%、种子浓度IO5-IO6个/mL、通气 比1 2至2 1，罐压0.03-0. 05MPa下，对木霉菌进行液体发酵96小时，从而获得富含木 霉菌厚垣孢子的发酵液。所用的发酵培养基的组成是麸皮0.5%,(NH4)2SO4 0.2%,KH2PO4 0. 1 %, CaCO3 0. 1%，葡萄糖 2%，0. 2%的大豆油，pH5. 5-6. 0。
结果发现，木霉T4在500L发酵罐中进行液体发酵有较好的厚垣孢子形成能力。在 500L发酵罐中，前24h大量形成菌丝，无厚垣孢子形成，到3 厚垣孢子已经开始形成，但 是数量很少，这时木霉的菌丝形成丰富，较稠密；随着发酵时间延长，厚垣孢子逐渐形成，到 72h厚垣孢子量达到1. 5 X IO7个/mL，72h 84h厚垣孢子增长较快，到84h厚垣孢子已有 3. 16X IO7个/mL，到96h厚垣孢子量略有上升，3. 24X 107个/mL，肉眼明显可见发酵液中菌 丝物质变细，发酵液变稀，终止发酵。从种子液到发酵终止结束需要6d时间，与国内外研究 相比所需时间相对较少，厚垣孢子产量也达到较高水平。
实施例2 植物油对木霉T4菌厚垣孢子的影响
重复实施例1的发酵工艺，只是在培养基中添加四种浓度的大豆油，然后测定木 霉T4的厚垣孢子产量。
结果发现，与不加入大豆油相比，加入大豆油可明显促进木霉T4厚垣孢子的产 生，随着大豆油浓度的增大，产生的厚垣孢子逐渐增多，在5g/L的浓度下厚垣孢子数最多， 达3. 3 X IO7个/mL，2g/L的浓度下产生的厚垣孢子量也达到了 3. 28 X IO7个/mL，几乎接近 5g/L的产量。同时在5g/L的浓度下发现，镜检计数时发现发酵液中仍有大的油滴存在，说 明5g/L的浓度过量，不能被木霉全部吸收，因此，2-3g/L(即0. 2% -0. 3% )的大豆油的添 加最利于木霉T4厚垣孢子的产生。
实施例3 木霉可湿性粉剂的制备
按照实施例1所述，利用500L发酵罐进行培养获取厚垣孢子发酵液，条件30°C， 180r/min,2. lL/min，接种量为6%，96小时厚垣孢子大量形成后，发酵结束。将发酵液高速 勻浆(5000r/min勻浆3分钟)后，加入10% (W/W)的载体和1% (ff/ff)(以发酵液总重量 计)润湿分散剂，用喷雾干燥(条件进口温度155°C、出口温度105-110°C、进料速度4. 5L/ h)干燥后制成可湿性粉剂。对其按可湿性粉剂标准进行检测。表1中列出了不同载体(轻 质碳酸钙(1250目)、高岭土(1250目)、白炭黑(500目)、滑石粉(800目)、硅藻土(500 目)、膨润土(325目))对木霉活力的影响。
表 权利要求
1.一种用于防治植物病害的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂包含芽孢杆菌芽胞 和木霉菌厚垣孢子。
2.如权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂是可湿性粉剂，所述复合 制剂包含载体和润湿分散剂，所述载体选自白碳黑或硅藻土，所述润湿分散剂选自烷基萘磺酸盐。
3.如权利要求2所述的复合制剂，其特征在于，所述载体的含量为5-30%(W/W)，所述 润湿分散剂的含量为0. 5-5% (W/W)，以发酵液的重量为基准。
4.如权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂中所述芽孢杆菌芽胞的 含量为IO8-IOki个细胞/克，所述木霉菌厚垣孢子的含量为IO8-IO9个活孢子/克。
5.一种制备权利要求1所述复合制剂的方法，该方法包括以下步骤(1)提供含芽孢杆菌芽胞的发酵液以及含木霉菌厚垣孢子的发酵液；(2)将含木霉菌厚垣孢子的发酵液勻浆，然后与含芽孢杆菌芽胞的发酵液混合，得到所 述复合制剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的含木霉菌厚垣孢子的发酵 液用以下方法获得在发酵培养基中，温度25 33°C、种子接种量5 10%、种子浓度IO5-IO6个/mL、 通气比1 2至2 1，罐压0.03-0. 05MPa下，发酵84-96小时，获得含木霉菌厚垣孢子 的发酵液，其中所述发酵培养基的组成是麸皮0.4-0.6%，(NH4)2SO4 0. 1-0.3%, KH2PO4 0.1-0.2%，CaCO3 0.1-0.2%，葡萄糖 1-3 %，0. 2-0. 5 % 的大豆油，pH5. 5-6. 0。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述复合制剂是可湿性粉剂，它是通过 对步骤( 所得的复合制剂进一步干燥制得的，且在所述步骤O)中还包括混合入载体和 润湿分散剂的步骤，所述载体选自白碳黑粉或硅藻土，所述润湿分散剂选自烷基萘磺酸盐。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述载体的含量为5-30%(W/W)，所述润湿 分散剂的含量为0. 5-5% (W/W)，以发酵液的重量为基准。
9.权利要求1所述的复合制剂在防治植物病害中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物病害选自西瓜枯萎病和蔓枯病。
全文摘要
本发明提供了一种用于防治植物病害的复合制剂，所述复合制剂包含芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子。本发明还提供了制备该复合制剂的方法及其应用。
文档编号A01P21/00GK102027998SQ20091019628
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月24日 优先权日2009年9月24日
发明者夏斯琴, 李小礼, 王伟, 王剑 申请人:华东理工大学