专利名称：Mitofilin基因敲除小鼠模型的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及Mitofilin基因敲除小鼠模型的制备方法及用途，具体地，本发明提供了一种Mitofilin杂合子小鼠的制备方法以及Mitofilin作为潜在的心脏保护因子在制备药物中的用途。
背景技术：
1.线粒体损伤与心肌细胞凋亡细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是细胞在自身基因调控下进行的一种主动死亡， 具有独特的形态结构和生物化学特征，主要表现为细胞核染色质固缩，凋亡小体出现，梯形脱氧核糖核酸(DNA)电泳图谱形成。研究证实，心肌细胞凋亡与原发性高血压、心肌缺血再灌注损伤、血管成形术后再狭窄、心律失常、心肌病和心肌炎、心力衰竭、动脉粥样硬化、 动脉瘤等多种心血管疾病有关。线粒体是细胞内一种重要的细胞器，它具有复杂的亚微结构和功能转换系统，通过氧化磷酸化为细胞生命活动提供能量。生物体内90%以上的ATP是由线粒体产生，因此线粒体被称为细胞器的“动力工厂”。线粒体被两层膜包绕，外膜通透性较高；内膜有更严格的选择性，它对离子、小分子物质的通透性，在线粒体的结构与功能的维持中非常重要，它有利于维持内膜两侧的电势差，并在一定条件下形成跨膜质子梯度，后者是氧化磷酸化的必要中间过程。线粒体占心肌细胞体积的45%，许多研究发现，当心肌细胞发生凋亡时，出现线粒体结构与功能的改变。如Siarow等在动物试验中发现，心肌细胞凋亡主要发生在梗死心肌周围，而离梗死心肌越近，线粒体损伤程度越重、数量越多。过氧化氢(H2O2)能够诱导心肌细胞凋亡，Chen等在观察H2A对培养心肌细胞凋亡的研究中发现，在培养的心肌细胞中加入H2O2后，首先出现线粒体呼吸功能减弱，继而出现一系列细胞凋亡的特征DN的降解，寡聚DNA梯形图谱的形成。Cook等对其机制进行了研究，发现加入H2O2后15 30min内，细胞色素C即从线粒体释放于胞浆中，15 30min后线粒体跨膜电位降低，这个过程约持续 lh，此后线粒体跨膜电位发生不可逆性丧失，继而出现心肌细胞凋亡与坏死。这均显示，线粒体在心肌细胞凋亡中发挥着重要作用。Okamura等对线粒体与心肌细胞凋亡及心肌坏死关系方面进行了研究。他结扎大鼠的前降支30min后再灌注模型，然后分成三组，分别加入YVAD (Caspase 1抑制剂)、 DEVD (Caspase 3抑制剂)及对照组，研究发现，YVAD及DEVD均显著减少心肌细胞凋亡，然而三组坏死心肌面积无差别。进一步研究显示，Caspase抑制剂、线粒体保护剂、自由基清除剂及一些药物均可减少心肌细胞凋亡，然而它们在缩小心肌坏死面积方面存有较大差异。 ^oita等认为，心肌细胞缺血时，一些促凋亡及促坏死信号均作用于线粒体这一共同通路而发挥作用。作用于线粒体后途径，仅能抑制心肌细胞凋亡，不能抑制心肌细胞坏死途径。这些研究表明，只有作用于线粒体前及线粒体水平的措施才能有效抑制心肌细胞凋亡，缩小坏死心肌面积。明确这一机制对指导临床用药也有重要意义，如血管紧张素转换酶抑制剂(ACE I)能有效减少心肌梗死后坏死心肌面积，改善心衰症状。现在的研究表明， ACE I类药物能够促使心肌细胞线粒体内超氧化物歧化酶(SOD)数量增多、功能改善，细胞凋亡减少，说明ACE I类药物可能通过线粒体水平而发挥抑制心肌细胞凋亡及坏死等积极作用。总之，线粒体在心肌细胞凋亡中起中心作用，决定心肌细胞走向凋亡还是坏死。线粒体在凋亡凋节中也十分重要，绝大多数蛋白质通过线粒体起到调节作用。明确线粒体在细胞凋亡中起关键作用，对于我们进一步探讨心脏疾病的发生及防治均有重要意义。2线粒体内膜蛋白一 Mitofilin1994年，Icho T等从人心肌组织中得到一高表达蛋白，经序列分析，他们预测在其 N端有一 GIPase功能域，这也揭示该蛋白可能是一动力蛋白。由于其在心肌里含量非常丰富，Icho T 称之为人心肌蛋白(Human Heart Mucle Protein, HMP)。1996 年，Odgren PR 利用免疫杂交和cDNA文库的筛选，得到HMP蛋白，但他们通过免疫电镜发现，该蛋白定位于线粒体内膜，于是又重新命名为Mitofilin。2005年，John等人用RNA干扰的方法降低 Mitofilin表达，发现细胞增殖减慢并且凋亡增加。通过对细胞线粒体超微结构的检测，发现细胞内线粒体嵴结构异常，呈现同心圆结构，不能形成正常的管状或片层嵴，同时伴随着线粒体功能异常，包括ROS生成增加以及Δ Ψπι升高，认为Mitofilin是控制线粒体嵴结构蛋白。此外，该研究还利用Mitofilin-GFP融合蛋白将Mitofilin准确定位，确认其在线粒体内膜上，并预测其前78个氨基酸是一个膜锚定结构域。Mitofilin在人类染色体上定位于2号染色体，由15个外显子组成，其转录本大小为2. 91Λ，编码的蛋白大小为88kD，各组织内普遍都有表达。在需能高富含线粒体的组织，如心脏、脑、肾、肝脏、骨骼肌中表达尤为丰富。经序列分析，Mitofilin在真核生物中高度保守，其N端的78个氨基酸残基为膜锚定区域，在接近C-端的区域，Mitofilin有一 Coil-Coil结构域，但并未有明显的功能域。在体内，Mitofilin的Coil-Coil结构域可能促使其形成一个约1200kD的复合物。2007年，Xie等通过免疫纯化的方法，分析得到Mitofilin与SAM50、metaxinsl/2 和DnaJCll等6个线粒体蛋白可能存在相互作用。其中SAM50是线粒体上具有识别线粒体蛋白定位信号，并形成孔道，转运线粒体蛋白入线粒体的蛋白，其余5个蛋白的功能还尚未明确。2008年，Lai等发现在大鼠脑创伤组织中，PARP活性升高，并会将一些线粒体蛋白快速多腺苷化，而Mitofilin就是其中之一，研究者推测这种修饰可能和线粒体功能异常相关。但这些研究对Mitofilin的功能并未有明确阐述。总的来说，Mitofilin的确切功能还不甚明了，对其的研究尚处于初步阶段。有必要通过建立完善的动物和细胞模型对其功能进行系统的研究。
发明内容
本发明旨在提供一种Mitofilin基因敲除非人哺乳动物。本发明的另一个目的是提供Mitof i 1 in在制备用于心脏保护的药物中的新用途在一个方面，本发明提供了一种产生Mitofilin基因敲除非人哺乳动物的方法， 包括以下步骤a)复苏并培养诱捕缺失Mitofilin基因的胚胎干细胞，胰酶消化成单个细胞后显微注射到代孕动物的囊胚中。b)将步骤a)得到的囊胚移到代孕动物的子宫角，娩出小动物后，得到整合 Mitofilin突变细胞的嵌合体动物。c)整合到生殖系的动物与野生型动物交配后，得到的动物通过使用PCR和 Southern Blot筛选得到Mitofilin杂合子个体。Mitofilin杂合子间交配得到纯合子个体。在另一个方面，本发明提供了一种Mitofilin基因敲除非人哺乳动物。优选地，本发明所述的非人哺乳动物是小鼠。本发明人通过实验证明，Mitofilin敲除小鼠纯合子死于胚胎期7. 5-9. 5天。在一个特别的方面，本发明提供了 Mitofilin敲除杂合子小鼠。在另一个方面，本发明提供了 Mitofilin在制备用于心脏保护药物中的用途。在一个具体实施方式
中，本发明提供了 Mitofilin在制备用于心脏保护药物中的用途，其特征在于，用于制备维持线粒体氧化磷酸化复合物活性的药物。在另一个具体实施方式
中，本发明提供了 Mitofilin在制备用于心脏保护药物中的用途，其特征在于，用于制备维持线粒体ATP合成水平的药物。在另外一个具体实施方式
中，本发明提供了 Mitofilin在制备用于心脏保护药物中的用途，其特征在于，用于制备维持体内ROS水平的药物。在一个具体实施方式
中，本发明提供了 Mitofilin在制备用于心脏保护药物中的用途，其特征在于，用于制备维持心肌线粒体结构的药物。据此，本发明提供了一种Mitofilin基因敲除非人哺乳动物及其产生方法。并且， 由此本发明人揭示了 Mitofilin作为潜在的心脏保护因子在制备用于心脏保护药物中的新用途。
图l.Mitofilin杂合子小鼠的基因型分析。A.诱捕载体插入后的Immt基因座；B. Southern blot检测Mitofilin杂合子小鼠；C. Western blot检测心脏中的Mitofilin的表达水平。图2. Mitofilin纯合子胚胎的基因型及形态学观察。A.打靶后Immt基因融合片段及野生型Immt基因的转录本；B. 7. 5天到9. 5天胚胎的形态学观察；C. PCR对野生型、Mitofilin杂合子和Mitofilin纯合子胚胎的检测；D.野生型、Mitofilin杂合子和Mitofilin纯合子胚胎中的immt基因和Lac Z基因的RT-PCR结果。 图3.9. 5天胚胎的TUNEL染色结果。图4.电镜观察野生型、Mitofilin杂合子和Mitofilin纯合子胚胎的线粒体超微结构的观察。图5.组织化学酶学对Mitofilin纯合子胚胎复合物II和复合物IV的检测。图6.组织化学酶学对Mitofilin杂合子小鼠心脏复合物I、复合物II和复合物 IV的检测。图7.线粒体氧化磷酸化复合物活性的体外检测。图8.实时定量PCR检测mtDNA编码的复合物。
A.复合物I亚基的表达水平的检测；B.复合物III和复合物IV亚基表达水平的检测。图9. Mitofilin杂合子小鼠心脏的ATP水平的检测。*p < 0. 05n = 10图10. DHE染色对野生型和Mitofilin杂合子小鼠心脏组织ROS水平的检测。图11.野生型和Mitofilin杂合子小鼠心肌的病理检测。A.野生型和Mitofilin杂合子小鼠的心肌的形态观测；B. HE染色对野生型和 Mitofilin杂合子小鼠的心肌组织的检测；C. Masson染色对野生型和Mitofilin杂合子小鼠的心肌组织的检测。图12. 16周的野生型和Mitofilin杂合子的心脏固定切片后电镜观察。
具体实施例方式实施例1. Miotifilin敲除鼠的建立本发明将Mitofilin突变的ES细胞系(英国Sanger研究所赠送)通过囊胚注射的方法注入到C57BL/6J小鼠囊胚中，移植胚胎到假孕鼠子宫，得到了 Mitofilin突变细胞整合到生殖系的嵌合体小鼠。该嵌合体与野生型小鼠交配后得到Mitofilin杂合子小鼠。 具体操作步骤如下a)分离培养小鼠的胚胎成纤维细胞，经丝裂霉素C处理后用于培养ES细胞的滋养层；b)复苏ES细胞于铺有滋养层细胞的培养皿培养后，注入到代孕小鼠的囊胚中；c)将注射过的囊胚置于加了 Brinster’ s BM0C-3培养液滴里培养，做好标记，以备移植；d)将步骤(c)的囊胚移到假孕的代孕动物体内，得到整合Mitofilin突变细胞的嵌合体小鼠。整合到生殖系的小鼠与野生型小鼠交配后，得到的小鼠通过使用PCR和 Southern Blot筛选得到Mitofilin杂合子小鼠。实施例2. Mitofilin敲除小鼠纯合子死于胚胎期7. 5-9. 5天本发明选用了 C57BL/6/12901a杂合背景和12901a背景的小鼠作为实验用小鼠。 这两种背景的Mitofilin杂合子小鼠均可正常出生，且符合孟德尔规律。Mitofilin杂合子小鼠和野生型小鼠相比，无明显差异。Western Blot检测Mitofilin杂合子小鼠的 Mitofilin的表达水平较野生型低，这和单倍体效率不足相符。我们对Mitofilin杂合子小鼠间交配产生的后代进行PCR、Souther Blot和flfestern Blot等方法进行检测(图2)。 在两种背景的小鼠中，均没有发现有存活的Mitofilin纯合子小鼠出生。接着我们对其后代进行统计，野生型和杂合子所占的比例分别是1/3和2/3(表1)。这符合纯合子胚胎致死后的孟德尔规律。表1.统计学分析Mitofilin杂合子小鼠间交配的后代
时期-I-+/-+/+合计新生N/A234112346E12.5N/A231033E10.5N/A432063
为了确定Mitofilin纯合子小鼠胚胎死亡的确切时间，我们分离了 6. 5-12. 5天的胚胎。结合RT-PCR和PCR等基因型检测手段，以及通过胚胎形态学观察发现，12. 5天的胚胎中没有Mitofilin纯合子胚胎的存在(表1)；在7. 5和9. 5天的胚胎中，Mitofilin纯合子纯合子发育迟缓，个体比野生型和杂合子小鼠小。且随着天数的增加个体差异更加明显。我们对9. 5天的胚胎切片后进行TUNEL实验，发现Mitofilin纯合子胚胎胚体细胞大量死亡。9. 5天后，Mitofilin纯合子胚胎死亡并逐渐被母体子宫吸收，具体结果如图2和图3所示。TUNEL的具体操作步骤如下1.石蜡切片脱蜡、补水固定后，蛋白酶K消化，每张切片上滴加IOOul蛋白酶K溶液(20ug/ul)，室温消化10分钟。2. PBS清洗5分钟，4%多聚甲醛再固定5分钟，而后用PBS室温清洗5分钟。3.擦净载玻片上多余的水分，在切片处滴加反应平衡液(Promega试剂盒提供)平衡后按配好的反应体系避光37°C湿盒内反应1小时。4.反应结束后，用2X SSC溶液终止反应，用Hoechst染色5分钟后封片。4°C避光保存以待观察。5.荧光显微镜下以488nm的蓝色激光激发，可见FITC标记的细胞核为凋亡细胞的细胞核，而紫外光激光看到的则是Hoechst染色的细胞核。实施例3. Mitofilin纯合子胚胎线粒体超微结构发生改变取8. 5天的Mitofilin杂合子小鼠交配的后代胚胎进行切片，通过透射电镜观察它们的线粒体超微结构。具体步骤如下1.取Mitofilinv-小鼠交配后的8. 5天胚胎，迅速放到预冷的2. 5%的新鲜配制的戊二醛溶液中(0. IM PBS pH 7. 4)，在4°C条件下固定2小时后，磷酸缓冲液清洗3遍。2.用的锇酸固定液固定1 2小时后，将样品进行脱水、置换和浸透处理，然后将其包埋。3.将包埋板放入温箱，于37°C、45°C、60°C分别放置M小时。4.修块将包埋块夹在特制的夹持器上，放在解剖显微镜下，用锋利的刀片先削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成锥体形。5.将包好的组织块制成500 μ m的半薄切片，甲苯胺兰染色，光学显微镜下定位。 在超薄切片机上，将定位好的组织块，制成60-70nm的超薄切片。粘在300目的铜网上。6.电子染色用镊子夹住载网的边缘，把贴有切片的一面朝下放到醋酸双氧铀-枸缘酸铅染色液，使载网浮在液滴上，盖上培养皿，染色10 20分钟。7.透射电镜观察、拍片、记录JEOL TEM-1010电子显微镜观察，做好观察记录，选好范围拍片，准确记录底片号码及相应内容。电镜结果表明(图4)野生型和Mitofilin杂合子胚胎的线粒体大小均勻、结构正常、内外膜正常分布以及内膜内陷形成的特化结构嵴有规则的排布。而Mitofilin纯合子胚胎线粒体大小不一，虽然有外膜存在，但内膜和嵴的排布紊乱；部分线粒体膨大，内膜和嵴结构消失，电子密度降低。实施例4. Mitofilin纯合子胚胎氧化磷酸化呼吸链功能失常Mitofilin纯合子胚胎的线粒体结构明显改变，尤其是内膜和嵴的形态明显异常；由于负责氧化磷酸化的复合物附着于内膜上，内膜结构的改变可能会引发氧化磷酸化复合物的功能的改变。因此，我们取8. 5天的胚胎进行冰冻切片后，进行组织酶学染色来鉴定复合物酶的活性。以四唑氮蓝(NBT)和二氨基联苯胺(DAB)作为酶的底物。通过NBT和DAB 在组织上反应后颜色的深浅反映复合物的酶活性。经鉴定，我们发现线粒体复合物IV细胞色素氧化酶(COX)的活性明显下降，而复合物II琥珀酸脱氢酶(SDH)活性没有明显改变，复合物I NADH氧化脱氢酶有一定程度的下降。这是由于该酶在胞浆中也存在，不能真实反映线粒体内的NADH氧化脱氢酶活性。具体结果如图5所示。实施例5. Mitofilin杂合子小鼠氧化磷酸化复合物活性较野生型降低Mitofilin杂合子小鼠可正常出生，跟野生型相比无明显差异。我们经过行为学、 体重及饮食等多方面对新生的Mitofilin杂合子小鼠进行鉴定，没有发现Mitofilin杂合子小鼠存在明显的功能异常(结果未出示)。但Mitofilin杂合子小鼠存在单倍体效率不足，该蛋白在组织中的表达水平较野生型低(图1C)。由于Mitofilin的表达降低，线粒体的基本功能可能在Mitofilin杂合子小鼠中会有一定的改变。因此，我们对6-8周的 Mitofilin杂合子小鼠的线粒体的氧化磷酸化水平进行了测定。取Mitofilin杂合子小鼠的心脏进行冰冻切片并进行酶组织染色，结果表明Mitofilin杂合子小鼠的线粒体复合物 IV的活性与野生型小鼠相比明显降低，而复合物II的活性没有变化(图6)；接着我们提取了小鼠肝脏组织的线粒体，进行体外酶学实验，结果显示复合物IV的活性明显下降，而复合物II的活性没有改变，这与组织酶学的结果一致。此外，在体外酶学实验中，我们发现复合物I和复合物I/III的活性也有一定的下降(图7)。在线粒体复合物中，复合物I、III和IV都有必需亚基由线粒体DNA编码并翻译。 而复合物II的亚基则全部由核基因组DNA编码。为此，我们推测Mitofilin的缺失可能影响了线粒体DNA(mtDNA)的拷贝数或转录，而使mtDNA编码的复合物亚基的表达水平降低， 进而影响了复合物的正常组装，最终使得氧化磷酸化水平降低甚至缺失。为此，提取了 Mitofilin杂合子小鼠心脏和肝脏组织的RNA，反转录后进行Real time PCR0具体步骤如下分离Mitofilin杂合子小鼠的心脏，加入Iml Trizal后勻浆破碎组织后，加入氯仿。剧烈摇动后12000转离心15分钟。将分层后的水相吸入一新的离心管中，加入等体积的异丙醇沉淀RNA，12000转10分钟。弃上清，加入75%乙醇，7500转离心，弃上清后晾干沉淀。加入适当的水溶解后，测定RNA的浓度，通过逆转录酶进行逆转录反应。以逆转录反应后的产物为模板，选用线粒体复合物亚基的特异引物进行PCR反应。结果发现复合物I、IV的亚基表达降低，说明Mitofilin的缺失确实导致了 mtDNA 的表达降低；而复合物III的亚基cyto b的表达基本没有变化(肝脏结果未出示)，这可能是由于线粒体启动子近端效应所致。线粒体DNA的近端效应表现为在线粒体DNA的转录过程中，距其越近的转录本，表达随着启动子活性的改变而明显改变；距启动子越远，改变越小。因此，Mitofilin杂合子小鼠中距启动子较近的复合物I和复合物IV的亚基所受到的影响较大，降低明显；而Cyto b是其重链转录本上的最后一个编码基因，受启动子活性的影响最小，几乎没有改变。结果如图8所示。实施例6. Mitofilin杂合子小鼠ATP供给较野生型减少线粒体最重要的功能就是产能以供给机体需求，故ATP的水平是线粒体功能的基本衡量标准。ATP生成的水平和细胞代谢状态直接相关，线粒体功能失常或氧化磷酸化活性降低都可使ATP合成减少。在Mitofilin杂合子小鼠的线粒体中，氧化磷酸化复合物活性与野生型相比有一定降低，因此我们通过高压液相(HPLC)法对Mitofilin杂合子小鼠ATP 的合成效率进行测定。结果(图9)显示，Mitofilin杂合子小鼠的心脏和脑组织的ATP供给较野生型减少。实施例7. Mitofilin杂合子小鼠体内ROS水平增加Mitofilin杂合子小鼠的线粒体氧化磷酸化水平较野生型降低，而在氧化磷酸化过程中，ROS是其副产物。一般情况下，当氧化磷酸化出现异常时，ROS在体内的平衡状态破坏，使其在体内积累。为了验证这一点，我们通过ROS原始物02_ ·的特异性探针DHE标记， 以检测Mitofilin杂合子小鼠小鼠体内的ROS水平。具体步骤如下断颈处死小鼠并分离其心脏组织进行冰冻切片。用ROS特异性探针DHE溶液覆盖心脏切片，室温孵育10分钟。用PBS清洗3遍后于荧光显微镜下观察。结果(图10)显示，Mitofilin杂合子小鼠的心脏的ROS水平较野生型升高。实施例8. Mitofilin杂合子小鼠的心脏呈现病理性变化ROS在细胞中的异常累积以及线粒体氧化磷酸化功能的降低会导致细胞产生病理性变化而导致细胞死亡。鉴于此，我们对16周的野生型和Mitofilin杂合子小鼠的心脏进行检测。我们对它们的心脏进行形态学观察发现，杂合子心脏较野生型的体积明显增加，对这些心脏固定并石蜡切片后HE和Masson染色，具体步骤如下1.组织经固定、脱水、浸蜡和包埋后切片。
2.然后再经脱蜡和补水后苏木素溶液或马苏染液染色约5 15min。
3.自来水洗去多余染料。
4.加入稀释的盐酸酒精溶液中分色，边分色边镜检，至核呈红紫色，细胞质无色。
5.分色后用自来水碱化返兰。
6.再经伊红染液染色，以95%酒精对伊红分色，至胞浆，结缔组织等呈桃红色。
7.染色后的切片，浸入从70 %到100 %递升的乙醇溶液脱水。
8.浸入二甲苯透明剂，二次(各数分钟)，取出切片滴中性树胶后加盖玻片封固。
结果发现Mitofilin杂合子心脏的心肌排列松散，并有很多细胞坏死，而野生型
的心脏心肌细胞排列紧密有序，并呈现正常的生理状态。实施例9. Mitofilin杂合子小鼠心肌的线粒体超微结构异常改变接着我们对16周的野生型和Mitofilin杂合子的心脏固定切片后电镜观察。电镜结果表明(图12)野生型的心肌线粒体大小均勻、结构正常、内外膜正常分布以及内膜内陷形成的特化结构嵴有规则的排布。而Mitofilin杂合子小鼠的心肌体大小不一，虽然有外膜存在，但内膜和嵴的排布紊乱；部分线粒体膨大，内膜和嵴结构消失，电子密度降低。
权利要求
1.一种产生Mitofilin基因敲除非人哺乳动物的方法，包括以下步骤a)复苏并培养诱捕缺失Mitofilin基因的胚胎干细胞，胰酶消化成单个细胞后显微注射到代孕动物的囊胚中；b)将步骤a)得到的囊胚移到代孕动物的子宫角，娩出小动物后，得到整合Mitofilin 突变细胞的嵌合体动物；c)整合到生殖系的动物与野生型动物交配后，得到的动物通过使用PCR和Southern Blot筛选得到Mitofilin杂合子个体；Mitofilin杂合子间交配得到纯合子个体。
2.根据权利要求1所述的产生Mitofilin基因敲除非人哺乳动物的方法，其中所述的非人哺乳动物是小鼠。
3.根据权利要求2所述的产生Mitofilin基因敲除非人哺乳动物的方法，其中所述的小鼠为Mitofilin杂合子小鼠。
4.Mitofi 1 in在制备用于心脏保护药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的Mitofilin在制备用于心脏保护药物中的用途，其特征在于， 用于制备维持线粒体氧化磷酸化复合物活性的药物。
6.根据权利要求4所述的Mitofilin在制备用于心脏保护药物中的用途，其特征在于， 用于制备维持线粒体ATP合成水平的药物。
7.根据权利要求4所述的Mitofilin在制备用于心脏保护药物中的用途，其特征在于， 用于制备维持体内ROS水平的药物。
8.根据权利要求4所述的Mitofilin在制备用于心脏保护药物中的用途，其特征在于， 用于制备维持心肌线粒体结构的药物。
全文摘要
本发明涉及Mitofilin基因敲除小鼠模型的制备方法及用途，具体地，本发明提供了一种Mitofilin杂合子小鼠的制备方法以及Mitofilin作为潜在的心脏保护因子在制备药物中的用途。
文档编号A01K67/027GK102199572SQ20101013297
公开日2011年9月28日 申请日期2010年3月24日 优先权日2010年3月24日
发明者刘德培, 孙立红, 张媛, 杨瑞锋, 梁植权, 陈厚早, 韦玉生 申请人:中国医学科学院基础医学研究所