专利名称：包含四-顺式-番茄红素的甜瓜植物的制作方法
技术领域：
本发明，在其一些实施例中，涉及包含作为主要果实着色剂(major fruitcolorant)的四-顺式-番爺红素(tetra-cis lycopene)的甜瓜植物以及产生上述植物的方法。
背景技术：
类胡萝卜素色素是所有光合生物中的基本组成成分。它们帮助吸收光能和保护光合机构免受由过度激发叶绿素产生的有害活性氧物质的伤害。它们还使果实和花朵呈现独特的黄色、橙色和红色以吸引动物。此外，类胡萝卜素是具有广泛所要求的对健康有益的活性的植物营养素，包括预防重大疾病如癌症、冠心病以及与年龄相关的眼部疾病。类胡萝卜素主要为8个类异戊二烯单元组成的40-碳类异戊二烯。类胡萝卜素中的多烯链包含多达15个共轭双键，其具有助于独特吸收光谱和特定光化学性质的特性。这些双键可在沿着分子的不同位置形成顺 式-反式几何异构体。实际上，虽然高等植物中的许多类胡萝卜素为全反式构型，但是也存在较小比例的不同的顺式异构体。在植物中，类胡萝卜素在质体内部由中心类异戊二烯途径合成(Hirschberg, 2011, Curr Opin Plant Biol 4, 210-218;图1)。以该途径(合成)的第一类胡萝卜素为无色的八氢番茄红素，其由酶八氢番茄红素合成酶(PSY)通过两分子的香叶基香叶基二磷酸盐的缩合产生。随后通过八氢番茄红素脱氢酶(脱饱和酶)(ros)和胡萝
卜素脱氢酶(ZDS)两种酶，在八氢番茄红素中引入四个双键，其各自催化两个对称的脱氢步骤以产生番茄和西瓜的红色色素，胡萝卜素和全反式番茄红素。番茄红素是特定环化酶的底物，而番茄红素两端的3 -环化作用产生橙色色素 胡萝卜素。借助类胡萝卜素异构酶(CRTISO)的活性，所有主要的植物类胡萝卜素都以
其反式形式出现。如果CRTISO是无功能的，由于环化酶对全反式番茄红素的特异性(图1)，则会累积橙色色素前番茄红素(四-顺式-番茄红素)。甜瓜(Cucumis melo)属于葫芦科。在西方社会,当果实完全成熟时,甜瓜果实被消耗。当成熟时，果实的果肉呈现广泛颜色，包括白色、米黄色、绿色、黄色、橙色和其混合色。甜瓜果实色素为类胡萝卜素和叶绿素。综合筛选200多种代表众所周知的甜瓜种质的类胡萝卜素，发现橙色甜瓜累积￠-胡萝卜素作为其主要色素，而绿色甜瓜主要累积叶绿素和两个叶绿体类胡萝卜素的组合，0 -胡萝卜素和叶黄素(Burger等,2006，Israel J PlantSci, 54:233-242)。累积前番茄红素(pro-lycopene)作为其主要类胡萝卜素的果实包括番茄和西瓜(Tadmor 等，[Food Research International 38 (2005) 837-841] ) Isaacson 等人(ThePlant Cell, 14 (2002) 333-342)最先报道了功能失常的类胡萝卜素异构酶(CRTISO)与果实的前番茄红素累积的联系
发明内容
根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了其果实的果肉包含四-顺式-番茄红素(前番爺红素)的甜瓜(Cucumis melo)植物。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了含基因组的甜瓜植物，该基因组包含至少一个具有功能失活突变(功能丧失性突变，loss of function mutation)的CRTISO的等位基因。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了源自本发明植物的种子。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了源自本发明植物的果实。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了源自本发明植物的花粉。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了源自本发明植物的胚珠。
根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了源自本发明植物的细胞。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了包含本发明细胞的细胞培养物。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了一种用于生产杂种(hybrid)甜瓜种子的方法，包括将第一亲本甜瓜植物与第二亲本甜瓜植物进行杂交，然后收获得到的杂种F1种子，其中第一或第二亲本甜瓜植物中至少一个是本发明的植物。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了杂种甜瓜种子，其是通过以下方法产生的，该方法包括:将第一亲本甜瓜植物与第二亲本甜瓜植物杂交，然后收获得到的杂种F1种子，其中第一或第二亲本甜瓜植物中至少一个是本发明的植物。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了杂种甜瓜植物或其部分，其是通过培育经以下方法产生的杂种甜瓜种子而产生的，该方法包括:将第一亲本甜瓜植物与第二亲本甜瓜植物杂交，然后收获得到的杂种F1种子，其中第一或第二亲本甜瓜植物中至少一个是本发明的植物。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了通过培育杂种甜瓜植物而产生的种子，该杂种甜瓜植物是通过培育经以下方法产生的杂种甜瓜种子而产生的，该方法包括:将第一亲本甜瓜植物与第二亲本甜瓜植物杂交，然后收获得到的杂种F1种子，其中第一或第二亲本甜瓜植物中至少一个是本发明的植物。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了产生甜瓜植物的方法，其中植物的果实的果肉包含四-顺式-番茄红素(前番茄红素)，该方法包括下调甜瓜植物中类胡萝卜素异构酶(CRTISO)的量和/或活性，从而产生该植物。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了一种产生甜瓜果实的方法，该甜瓜果实的果肉包含比￠-胡萝卜素更多量的四-顺式-番茄红素(前番茄红素)和/或该甜瓜果实具有至少一个具有功能失活突变的CRTISO的等位基因，该方法包括:(a)播种甜瓜果实的种子和/或栽培(plant)种子的幼苗(苗木、秧苗,seedling);(b)培育由种子或幼苗形成的植物(植株)；以及(C)收获植物的甜瓜果实，从而获得该甜瓜果实。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了甜瓜品系CEM 3285的种子，种子样品在2010年4月16日保藏于NCIMB,保藏号(登录号，accession number) 41710。根据本发明一些实施例的一方面，其中提供了甜瓜品系CEM 3285的植物，其种子样品在2010年4月16日保藏于NCMB，保藏号为41710。根据本发明的一些实施例，该植物的果实的果肉包含比￠-胡萝卜素更多量的四-顺式-番茄红素(前番茄红素)。根据本发明的一些实施例，该植物具有基因组，基因组包含至少一个具有功能失活突变的CRTISO的等位基因。根据本发明的一些实施例，该植物包含核酸构建体，核酸构建体包含编码下调CRTISO表达的多聚核苷酸因子(多聚核苷酸试剂，polynucleotide agent)的核酸序列和能够指导多聚核苷酸因子在植物中表达的顺式作用调控元件(顺式调控元件，cis-actingregulatory element)。根据本发明的一些实施例，该多聚核苷酸因子为SiRNA或核酶。根据本发明的一些实施例，该植物的果实的果肉包含前番茄红素。根据本发明的一些实施例，该植物的果实的果肉包含比￠-胡萝卜素更多量的四-顺式-番茄红素(前番茄红素)。根据本发明的一些实施例，该植物缺乏(devoid of)类胡萝卜素异构酶催化活性。根据本发明的一些实施例，CRTISO的每个等位基因携带至少一个功能失活突变。根据本发明的一些实施例，CRTISO是纯合形式(纯合子形式，homozygous form)。根据本发明的一些实施例，CRTISO是杂合形式(杂合子形式，heterozygousform)。根据本发明的一些实施例,植物是稳定的亲本品系(亲系，parental line)。
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根据本发明的一些实施例，植物是由两个亲本品系杂交形成的杂种。根据本发明的一些实施例，植物进一步包含额外性状(附加性状，additionaltrait),其由以下构成(consisting of):抗除草剂性、抗虫性、对细菌、真菌或病毒性疾病的抗性、雄性不育以及提高的营养价值。根据本发明的一些实施例，植物进一步包含选自至少一种类型的疾病抗性和至少一种类型的胁迫抗性(stress resistance)的额外性状。根据本发明的一些实施例，下调(作用)通过化学诱变实现。根据本发明的一些实施例，通过将核酸构建体导入甜瓜植物来实现下调作用，核酸构建体包含编码下调CRTISO表达的多聚核苷酸因子的核酸序列和能够指导多聚核苷酸因子在植物中表达的顺式作用调控元件。根据本发明的一些实施例，多聚核苷酸因子为SiRNA或核酶。除非另外定义，否则这里使用的全部技术性和/或科学术语与本发明领域内每个普通技术人员通常理解的含义相同。虽然与这里描述的相似或相同的方法和材料可用于本发明实施例的实践或试验中，但以下将要描述示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，包括定义，以专利说明书为准。另外，材料、方法和实例仅仅是示例性的，不旨在进行必要的限制。
这里参照附图描述的本发明的一些实施例仅是示例性的。借助对附图的详细参考，应该注意示出的细节(具体情况)仅是示例性的并且是为了解释说明本发明实施例的目的。在这点上，参照附图的描述可以使本领域的技术人员明了如何实施本发明的实施例。在图中:
图1是e -胡萝卜素生物合成的示意图。图2是化学诱变(CEM 3285)后橙色甜瓜果实的照片。上面一半果实累积￠-胡萝卜素，而下面两半累积前番茄红素作为其主要的果实类胡萝卜素。图3是突变型(顶部)和野生型(底部)CEM 3285M2果实的HPLC色谱图。图4是CEM 3285突变型(左边)和野生型(右边)幼苗(plantlet)的照片。图5是诱导突变稳定品系CEM 3285-13幼苗的照片。图6是示出突变型雌花(左边)和野生型雌花(右边)的子房横切面照片。图7是示出野生型(上面)的雄花和突变型(下面)花的照片，其中示出花瓣的颜色差异。图8是突变的类胡萝卜素异构酶(CRTISO)基因的基因组DNA序列。第一 ATG用绿色加亮，内含子染成黄色，A到T的转换用红色标记，错剪接mRNA的五个碱基缺失下加下划线且最初终止(STOP)密码子用红色加亮(SEQ ID NO:1)0图9是突变CRTISO基因的cDNA序列。第一 ATG用绿色加亮，A转换成T用红色标记，所得未成熟终止密码子用黄色加亮，在错剪接的五个碱基缺失下加下划线且最初终止密码子用红色加亮(SEQ ID NO:2)0图10A-10C是从不同mRNA翻译的推导氨基酸(deduced amino acid)。图1OA:天然CRTIS0。图1OB:当转录全长mRNA时的CRTISO突变蛋白。A到T的转换导致产生未成熟终止密码子，其用红色加亮，且因此黄色加亮的蛋白序列未进行翻译。图1OC:利用移码(frame shift)翻译缺失的错剪接mRNA，其用淡蓝色加亮，且未成熟终止密码子用红色加売。黄色加売的蛋白序列未进行翻译。图11是发育果实中和野生型植物(深绿色和橙色)或CEM 3285 (淡绿色和黄色)的叶片中的CRTISO基因qRT-PCR的分析图示。数字表示授粉后的天数(DAP)。
具体实施例方式本发明，在其一些实施例中，涉及果实中包含四-顺式-番茄红素的甜瓜植物以及生成该植物的方法。在详细说明至少一个本发明实施例之前，应该理解在其应用中，本发明不必局限于下面描述或示例的细节。本发 明可以有其他实施例或可以用不同方式实践或实施。在葫芦科(Cucurbitaceae)中，甜瓜是最重要的栽培葫芦之一。其主要培育用于果实，果实的大小一般具有显著差异(50g至15kg)、果肉颜色(橙色、绿色、白色和粉红色)、果皮颜色(绿色、黄色、白色、橙色、红色和灰色)、形状(圆形、扁形和细长形状)，以及尺寸(4_200cm)。番茄红素是在水果和蔬菜中很少发现的天然生成的类胡萝卜素。它与抗氧化状态、间隙连接形成以及抑制胆固醇合成有关。流行病学研究表明摄入高番茄红素可降低癌症和心脏病危险，尤其与前列腺癌特别相关。体外研究表明番茄红素比B-胡萝卜素更有效抑制人体子宫内膜癌细胞、肺癌细胞和乳癌细胞的增长。动物研究表明番茄红素可抑制脑部肿瘤和乳房肿瘤的发生。不同研究小组表明由于顺式异构体长度较短，混合胶束中顺式异构体溶解度较大，和/或由于顺式异构体聚集可能性较低，番茄红素的顺式异构体比全反式形式更好吸收[Burri 等，International Journal of Food Sciences and Nutrition(2008) 1-16]。同时，为了创建甜瓜植物新型变种，本发明利用甲磺酸乙酯(EMS)化学诱变剂处理甜瓜种子，然后凭借与众不同的橙色(图2)挑选甜瓜。突变果实中的类胡萝卜素的HPLC分析显示出相比野生型改变的类胡萝卜素图谱(carotenoid pattern)。突变果实中主要类胡萝卜素为四-顺式-番茄红素(前番茄红素)，而野生型果实累积￠-胡萝卜素作为主要色素(图3)。因为研究表明有些顺式番茄红素异构体比反式番茄红素异构体更有生物利用性，所以本发明的甜瓜比天然存在的甜瓜更健康或提供不同的健康益处。提取自突变植物的基因组DNA的分析显示编码类胡萝卜素异构酶(CRTISO)的基因发生突变。因此，根据本发明的一方面，其中提供了甜瓜植物，其中植物的果实的果肉包含四-顺式-番茄红素(前番茄红素)。此处使用的术语“植物”包含完整的植物、植物的亲代和后代以及植物部分，包括种子、果实、芽(shoot)、茎，根(包括球根(tuber))以及植物细胞、组织和器官。植物可采用任何形式，包括悬浮培养物、胚(embryo)、分生组织区域、愈伤组织区域、叶片、配子体、孢子体、花粉、胚珠和小孢子。典型地，甜瓜植物包含比￠-胡萝卜素更多量的四-顺式-番茄红素(前番茄红素)。根据本发明该方面的另一个实施例，果实的果肉包含的四-顺式-番茄红素(前番茄红素)的量是P -胡萝卜素量的至少2倍、至少4倍、至少10倍。根据一个实施例，甜瓜植物仅包含微量(痕量)的P -胡萝卜素。本发明该方面的甜瓜植物的类胡萝卜素异构酶(CRTISO) mRNA的水平低于天然生长的甜瓜植物(如低2倍(1/2))。另外地或替换地，本发明该方面的甜瓜植物的CRTISO的酶活性低于天然生长的甜瓜植物(如低2倍、低5倍或低10倍)。根据特定实施例，CRTISO完全没有酶活性。这里使用的术语类胡萝卜素异构酶(CRTISO)指的是将四-顺式-番茄红素转换成全反式番茄红素(见图10A-10C)的异构酶(登录号IPR014101)。根据一个实施例，本发明的甜瓜植物缺少CRTISO催化活性。本发明的发明人考虑了通过化学诱变和重组技术获得本发明的甜瓜植物。因此，本发明甜瓜植物可以通过将甜瓜植物或其部分暴露于化学诱变剂而获得。示例性化学诱变剂包括但不限于亚硝酸，烷化剂，例如甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(丽S)、硫酸二乙酯(DES)以及碱基类似物，如5-溴脱氧尿苷(5BU)。利用化学诱变获得本发明甜瓜植物的示例性方法包括将甜瓜种子在水中浸泡12小时，然后在EMS (如1%)中再(浸泡)12小时。之后种植处理后的种子(M1)然后自花授粉获得M2家系(families)。通过化学诱变形成的甜瓜植物可包含至少一个具有功能失活突变的CRTISO的等位基因。这里使用的术语“等 位基因”指的是基因座的一个或更多替换形式中的任何一个，所有基因座的等位基因涉及性状或特性。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上对应的基因座。
“功能失活突变(loss-of-function mutation)”是基因序列中导致基因产物(通常是蛋白质)的功能降低或者完全缺失的突变。例如，由移码突变或无义突变产生的基因产物的切断(截断)可导致的功能失活突变。与具有功能失活突变的等位基因相关的表型通常为隐性但也可为显性。应该注意本发明也涉及甜瓜植物，其中CRTISO的两个等位基因都具有功能失活突变。在这些实例中，CRTISO可采用纯合形式或采用杂合形式。根据该实施例，纯合性指由相同核苷酸序列表征的CRTISO基因座的两个等位基因的情况。杂合性指的是CRTISO基因座上的基因不相同的情况。根据一个实施例，本发明植物为杂交品种一即由两个非等基因植物杂交(即交配)形成。杂种可为F1杂种或开放授粉品种(open-pollinated variety)。这里使用的“匕杂种”指的是两个非等基因植物杂交的第一代子代。培育本发明甜瓜杂种要求培育稳定的纯合亲代品系。在培育方案中，结合来自两个或更多种质源或基因库的所需性状获得优等培育品种。通过连续自交并选择最优培育品系获得所需的近交品系或亲本品系，有时利用分子标记来加速选择进程。
只要保持亲本的同质性和纯合性，一旦确认具有最优杂交性能的亲本品系，就可不确定地产生杂种种子。当两个亲本品系杂交产生F1子代时，产生了为单交杂种。许多由F1杂种表现出的杂种优势，在下一代(F2)消失。因此，从杂交品种收获的种子通常不用于栽培幼苗(stock)。根据一个实施例，本发明的甜瓜植物是稳定的亲本植物品系。如这里定义地，短语“稳定亲本品系”指的是开放授粉的近交品系，对于所需植物其在自花授粉和种植周期上是稳定的。通常地，在本发明的亲本品系中，基因组的95%或更多(例如100%)采用纯合形式。根据另一方面，本发明提供获得第一代(F1)杂种甜瓜种子的方法。根据一个实施例，本发明提供产生第一代杂种种子的方法，包括将第一稳定亲本甜瓜植物与第二稳定亲本甜瓜植物杂交，然后收获得到的杂种F1种子，其中第一和第二稳定的亲本甜瓜植物的果实果肉包含四-顺式-番茄红素(前番茄红素)的量比￠-胡萝卜素多。根据另一个实施例，本发明还提供通过栽培由上述方法获得的杂种甜瓜种子获得的第一代F1杂种甜瓜植物。本发明还涉及从这些Fl杂种甜瓜植物收获的种子以及由这些种子长成的植物。在植物培育中，通常的做法是使用回交的方法，以便通过单一性状转变(singletrait conversion)来培育新品种。这里使用的短语“单一性状转变”指将新的单一基因引入亲本品系，除转移的单一基因外基本上重新获得亲本品系的所有所需形态学和生理学特性。这里使用的术语“回交”指的是杂种子代反向再与亲本甜瓜植物重复杂交。提供所需特性基因的亲本甜瓜植物称为非轮回或供体亲本。该术语指的是这样的事实:非轮回亲本在回交方案中使用一次，因此不发生轮回。基因从非轮回亲本转移到的亲本甜瓜植物通常称为轮回亲本，因为其在回交方案中多轮使用。在通常的回交方案中，将来自感兴趣的原始品种的植物(轮回亲本)与选自第二类品种并携带可转移的单一感兴趣基因的植物(非轮回亲本)杂交。然后将杂交得到的子代再与轮回亲本杂交，并重复该过程直到获得甜瓜植物，其中除了非轮回亲本的单一转移基因夕卜，在转化植物(converted plant)中基本上重新获得轮回亲本的所有所需形态学和生理学特性。本发明可使用回交方法改善亲本品系特性或向亲本品系引入特性。应该理解本发明也意图通过播种甜瓜果实的种子和/或栽种子幼苗获得甜瓜果实，种植由种子或幼苗获得的植物并收获植物的甜瓜果实。如上所述，也可使用其他技术获得本发明的甜瓜植物，这些技术包括但不限于(a)CRTISO基因的缺失；(b) CRTISO基因的转录失活；(c) CRTISO基因转录本的反义RNA介导失活；和(d) CRTISO基因转录本的翻译失活。因此，例如，可形成包含与CRTISO基因同源的序列的基因敲进或基因敲除构建体，并可用于将辅助序列(辅序列，ancillary sequence)插入酶编码基因的编码序列,从而使该基因失活。这些构建体优先包括正(阳性)负(阴性)选择基因，从而用于筛选同源重组事件。本领域内的普通技术人员可容易地设计出包含正负选择基因的用于有效筛选与该构建体经历同源重组事件的转化植物细胞的敲进/敲除构建体。这些细胞之后可长成完整植株。本领域内已知的标准方法可用于实施敲进/敲除过程。这些方法详述于，例如，美国专利 N0.5，487，992,5, 464，764,5, 387，742,5, 360，735,5, 347，075,5, 298，422、5，288，846,5, 221，778,5, 175，385,5, 175，384,5, 175，383,5, 736，866 以及 Burke 和 Olson,Methods in Enzymology,194:251-270，1991 ；Capecchi, Science,244:1288-1292，1989 ；Davies 等，Nucleic Acids Research, 20 (11) 2693-2698，1992 ;Dickinson 等，HumanMolecular Genetics,2 (8):1299-1302, 1993 ；Duff 和 Lincoln, “Insertion of apathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the humanAPP gene and expression in ES cells，，,Research Advances in AlzheimerJ s Diseaseand Related Disorders,1995 ；Hu`xley 等，Genomics,9:742-750 1991 ;Jakobovits 等，Nature,362:255-261,1993 ；Lamb 等，Nature Genetics,5:22-29，1993 ；Pearson 和 Choi,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,90:10578-82，1993 ;Rothstein, Methods in Enzymology,194:281-301, 1991 ；Schedl 等，Nature 362:258-261，1993 ；Strauss 等，Science, 259:1904-1907，1993，W094/23049, W093/14200, W094/06908 和 TO 94/28123 中也提供了信息。在转录水平，表达由链置换连接至基因组DNA的反义或正义寡聚核苷酸或形成三螺旋可阻止转录。在转录本水平，表达连接靶mRNA分子的反义寡聚核苷酸会导致由胞内核糖核酸酶H (RNase H enzyme)造成的杂种(杂合体，hybrid)酶裂解或阻止其翻译成蛋白质。在这种情况下，寡聚核苷酸通过杂交至靶mRNA，提供可被RNase H酶识别和破坏或阻止与核糖体连接的二倍体杂种(二倍杂合体)。此外，利用连接至反义寡聚核苷酸的核酶序列，通过核酶还可促进靶序列裂解。可替换地，这些杂种的形成导致干扰正确的RNA剪接成信使RNA。因此,就一切情况而言,准备翻译的祀mRNA的完整转录本数目减少或消失。在翻译水平，结合靶mRNA分子的反义寡聚核苷酸或类似物通过空间位阻，阻止基本翻译因子(核糖体)与祀mRNA结合,其在本领域内是被称为杂交扣留(hybridization arrest)的现象，以阻止这些mRNA的翻译。因此，根据本发明具体实施例，甜瓜植物可通过向其引入核酸构建体形成，该核酸构建体包含编码下调CRTISO表达的多聚核苷酸因子的核酸序列和能够指导多聚核苷酸因子在植物中表达的顺式作用调控元件。根据本发明，用于本方法的构建体可利用本领域内技术人员熟知的重组DNA技术进行构建。基因构建体可插入可商购的载体中，其适合于转化至植物和适合于转化细胞中感兴趣基因的表达。基因构建体可为表达载体，其中核酸序列可操作地连接至一个或更多允许在植物细胞中表达的调控序列。在本发明的具体实施例中，调控序列为植物可表达启动子(plant-expressiblepromoter)o这里使用的短语“植物可表达”指的是启动子序列，包括任何加入其中或包含于其中的附加调控元件，其在甜瓜细胞、组织或器官中至少可诱导、赋予、激活或增强表达。启动子可以是调控型启动子、组成型启动子或组织相关型启动子。这里使用的术语“调 控型启动子”指的是任何其活性受特定环境或生长条件影响的启动子。这里使用的术语“组成型启动子”指的是任何在多数时间指导植物转化体的许多或全部组织中的RNA产生的启动子。这里使用的术语“组织相关型启动子”指的是任何在特定类型的细胞和组织中以较高水平指导RNA合成的启动子(如，果实相关型启动子)。用于表达可操作地连接的核酸序列(即转基因)的示例性启动子包括花椰菜花叶病毒启动子CaMV和烟草花叶病毒TMV启动子。其他可用于本发明的启动子包括美国专利N0.20060168699和HectorG.Numez-Palenius 等人[Critical Reviews in Biotechnology, Volume 28, IssuelMarch2008, pages 13-55]描述的那些启动子，这两者都是以引用方式并入此处。如上所述，下调CRTISO可在其基因组和/或转录本水平上利用多种干扰CRTISO转录和/或翻译的分子[例如，RNA沉默因子(如，反义，siRNA, shRNA),核酶和DNA酶]实现。术语“siRNA”指的是小抑制性RNA双链(一般在18-30碱基对)，其诱导RNA干扰(RNAi)途径。通常地，siRNA化学合成为中心19bp双链区和末端对称的2-碱基3'-突出的21聚体，但最近报道称位于相同位置上的25-30碱基长度的化学合成的RNA双链的效力比21聚体高出多达100倍。理论上在引发RNAi中，利用较长RNA观察到增强的效力是由于提供底物(27聚体(27mer))代替产物(21聚体)的Dicer，并且这提高了 siRNA双链进入RISC的速率或效率。已发现3'-突出(3' -overhang)位置影响siRNA的效力且反义链上具有3'-突出的不对称双链一般比有义链上具有3'-突出的不对称双链通常更有效(Rose等，2005)。这可归因于装载至RISO的不对称链，因为当靶向反义转录本时观察到相反的效力模式。双链干扰RNA(如siRNA)的链可连接形成发夹结构或茎环结构(如shRNA)。因此，本发明所述的RNA沉默因子还可以是短发夹RNA (shRNA).
这里使用的术语“shRNA”指的是具有茎环结构的RNA因子，其包含互补序列的第一和第二区域，区域的互补和取向程度可足够使区域之间进行碱基配对，第一和第二区域由环区连接，环由环区内核苷酸(或核苷酸类似物)间碱基对的缺失产生。环内核苷酸数为3到23，或5到15，或7到13，或4到9，或9到11 (在其之间以及包括其)。环内的某些核苷酸可与环内其他核苷酸进行碱基配对相互作用。可用于形成环的示例性寡聚核苷酸序列包括 5' -UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp, T.R.等.(2002)Science 296:550 ；SEQ ID NO:6)和 5' -UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D.等，(2002)RNA 8:1454, SEQ ID N0:7)。本领域内的技术人员应该认识到得到的单链寡聚核苷酸形成包含可与RNAi机制相互作用的双链区的茎环或发夹结构。根据另一个实施例，RNA沉默因子可以是miRNA。miRNA是小RNA，其来源于不同大小的基因编码初级转录本。它们在动物和植物中鉴别。初级转录本(称为“pr1-miRNA”)通过不同的溶核步骤加工成较短的前体miRNA或“pre-miRNA”。pre-miRNA以折叠形式存在，使得最终的(成熟的)miRNA为双链形式，称为miRNA的两条链(该链最终与靶标进行碱基配对)。pre-miRNA是用于形成从前体切除miRNA双链的内切酶的底物，之后类似于siRNA，双链可组装进RISC复合物。已经证明miRNA可通过转基因进行表达并且其可借助前体形式表达，而不是整个初级形式(Parizotto 等，(2004) Genes&Deve1pment 18:2237-2242 和 Guo等(2005) Plant Cell 17:1376-1386)而是有效的。不同地，siRNA、miRNA仅借助部分互补性结合至转录本序列(Zeng等,2002,Molec.Cell 9:1327-1333)并且在不影响RNA稳态水平下抑制翻译(Lee等，Cell75:843-854 ;Wightman 等，1993，Cell 75:855-862)。miRNA 和 siRNA 二者都由 Dicer 处理并联合 RNA 诱导沉默复合物的组分(Hutvagner 等,2001, Science 293:834-838 ；ffilliams等，2002，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 99: 6889-6894 ;Hammond 等，2001，Science 293:1146-1150 ;Mourlatos 等，2002, Genes Dev.16:720-728)。最近的报道(Hutvagner 等,2002，Sciencexpress 297:2056-2060)推测出通过miRNA途径与siRNA途径比较，基因调控由对目标转录本的互补程度唯一确定。推测到类似于miRNA，与mRNA靶标仅部分同一的siRNA将抑制翻译，而不是引发RNA降解。如下可实现适合本发明使用的RNA沉默因子的合成。第一，CRTISOmRNA序列从AGU起始密码子向下游搜寻AA 二核苷酸序列。记录每个AA和3'相邻的19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点的发生。更优选地，siRNA靶位点选自开放阅读框，因为调控蛋白结合位点更加富集非翻译区(UTR)。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合[Tuschl ChemBiochem.2:239-245]。应该理解可在非翻译区有效指导siRNA，正如针对GAPDH所证明的，其中在5' UTR指导的siRNA介导细胞GAPAH mRNA约90%降低并完全破坏蛋白水平(wor Idwi deweb.ambion.com/ tech lib/tn/91/912.html)。第二，利用任意序列比对软件将潜在靶位点与合适的基因组数据库进行比较(如，人类、小鼠、大鼠等)，例如，获自NCBI服务器的BLAST软件(www.ncb1.nlm.nihdtgov/BLAST)。滤除与其他编码序列呈现出显著同源性的假定靶位点。选择合适的靶序列作为siRNA合成模板。优选序列为G/C含量低的序列，因为已证明在介导基因沉默中其比G/C含量高出55%的序列更有效。沿着靶基因的长度优先选择几个靶位点用于评估。为了更好地评估选择的siRNA，优先结合使用阴性对照。阴性对照siRNA优先包括与siRNA相同的核苷酸组分，但缺乏对基因组的显著同源性。因此，优先利用siRNA的乱序(scrambled)核苷酸序列，其对任何其他基因都不显示任何显著同源性。
例如，SEQ ID NO:8中详述了可用于本发明的合适的siRNA。应该理解本发明的RNA沉默因子不需限制于仅包含RNA的那些分子，其进一步包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施例中，这里提供的RNA沉默因子可功能上关联细胞穿透肽。这里使用的“细胞穿透肽”是包括短的(大约12-30残基)氨基酸序列或赋予非能量依赖性(即，非细胞内吞)移位性能(其与膜可渗透复合物穿过细胞的细胞质和/或核膜的运输有关)的功能性基序。用于本发明膜可渗透复合物的细胞穿透肽优先包含至少一个非功能性半胱氨酸残基，其可以是游离的(自由的，free)或衍生为与双链核糖核酸形成二硫键，其已对该键进行修饰。赋予这些特性的典型氨基酸基序列列于美国专利N0.6，348，185，其内容特意在此引用作为参考。本发明的细胞穿透肽优先包括，但不限于，穿膜肽(penetratin)、运输肽(transportan)、pIs1、TAT (48-60), pVEC、MTS 和 MAP。另一个可下调CRTISO的因子是可特异切割mRNA转录本或CRTISO的DNA序列的DNA酶分子。DNA酶为单链多聚核苷酸，其可切割单链和双链靶序列(Breaker，R.R.和Joyce, G.Chemistry 和 Biolog y 1995 ；2:655 ；Santoro, S.ff.&Joyce, G.F.Proc.Natl, Acad.Sc1.USA 1997 ;943:4262)。已提出普遍的 DNA 酶模型(“ 10-23” 模型)。“10-23” DNA酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，两侧有7-9个脱氧核糖核苷酸的底物识别结构域。这种类型的DNA酶可在嘌呤:嘧啶连接(junction)处有效切割其底物RNA(Santoro, S.ff.&Joyce, G.F.Proc.Natl, Acad.Sc1.USA 199 ；for rev of DNAzymes seeKhachigian, LM[Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)])。识别单链和双链目标切割位点的合成的、工程DNA酶的构建和扩增的实例已在美国专利N0.6，326，174至Joyce等中公开。针对人类尿激酶(Urokinase)受体类似设计的DNA酶目前观察到可抑制尿激酶受体的表达并成功抑制体内结肠癌细胞的转移(Itoh等，20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther worldwidewebdotasgtdotorg)。在另一个应用中，与bcr-abl致癌基因互补的DNA酶成功抑制白血病细胞中致癌基因的表达，并减少CML和ALL情况下的自体骨髓移植中的复发率。也可通过利用与编码CRTISO的mRNA转录本特异性杂交的反义多聚核苷酸来下调CRTISOo考虑反义技术的两个重要方面设计可用于有效下调CRTISO的反义分子。第一方面是将寡聚核苷酸递送至合适细胞的细胞质，第二方面是设计寡聚核苷酸，其采用抑制其翻译的方式特异性结合细胞内指定的mRNA。根据热力循环，确定那些与其靶mRNA有最高预测结合亲和力的序列的算法是可利用的，热力循环占据靶mRNA和寡聚核苷酸中结构改变的热力学[例如，见Walton等，Biotechnol Bioeng 65:1-9 (1999)]。这些算法已成功用于实施细胞中的反义技术。例如，Walton等制定的算法可使科学家成功设计针对兔￠-珠蛋白(RBG)和鼠肿瘤坏死因子-a (TNF-a )转录本的反义寡聚核苷酸。相同研究小组最近报道通过动力学PCR技术评估，在细胞培养中，针对三种模型靶mRNA (人类乳酸脱氢酶A和B以及大鼠gpl30)合理选择的寡聚核苷酸的反义活性证明几乎在所有情况下有效，包括针对具有磷酸二酯和硫代磷酸酯寡聚核苷酸化学品的两种细胞类型中三种不同靶的试验。
另外，还公布了一些利用体外系统，设计和预测特定寡聚核苷酸效率的技术(Matveeva 等，Nature Biotechnology 16:1374-1375 (1998))。针对mRNA (编码CRTISO蛋白)的合适的反义多聚核苷酸包含如SEQ ID NO: 13中阐述的序列。另一个可下调CRTISO的因子为核酶分子，其可特异性切割编码CRTISO的mRNA转录本。核酶通过切割编码感兴趣蛋白的mRNA，被越来越多地用于基因表达的序列特异性抑制[Welch 等,Curr Opin Biotechnol.9:486-96 (1998)]。设计出切割任何特定祀 RNA 的核酶的可能性已经使其成为基础研究和治疗应用中的有价值工具。本发明的构建体还可包括编码额外性状(如，抗病性或抗逆性)的多聚核苷酸序列。这些性状可包含抗除草剂性，抗虫性，抗细菌、真菌或病毒性疾病性，雄性不育和提高的营养价值。另外或可替换地，本发明的构建体还可包括编码选择性标记的多聚核苷酸序列。选择性标记基因可为一种基因，其编码新霉素磷酸转移酶蛋白、抗草甘膦5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)蛋白、潮霉素磷酸转移酶蛋白、二氢碟酸合成酶蛋白、磺酰脲不敏感的乙酰乳酸合成酶蛋白、阿特拉津不敏感的Q蛋白、可降解溴苯腈的腈水解酶蛋白、可降解茅草枯的脱卤酶蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸单加氧酶蛋白、氨甲蝶呤不敏感的二氢叶酸还原酶蛋白和氨乙基半胱氨酸不敏感的章鱼碱合成酶蛋白。与每个基因配合使用的相应选择性试剂可以是:新霉素(用于新霉素磷酸转移酶蛋白的选择)，草铵膦(用于草铵膦乙酰转移酶蛋白的选择)，草甘膦(用于草甘膦抗性5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)蛋白的选择)，潮霉素(用于潮霉素磷酸转移酶蛋白的选择)，磺胺嘧啶(用于二氢蝶酸合成酶蛋白的选择)，绿磺隆(用于磺酰脲不敏感的乙酰乳酸合成酶蛋白的选择)，阿特拉津(用于阿特拉津不敏感的Q蛋白的选择)，溴苯腈(用于腈水解酶蛋白的选择)，茅草枯(用于脱卤酶蛋白的选择)，2，4- 二氯苯氧乙酸(用于2，4- 二氯苯氧乙酸单加氧酶蛋白的选择)，氨甲蝶呤(用于氨甲蝶呤不敏感`的二氢叶酸还原酶蛋白的选择)或氨乙基半胱氨酸(用于氨乙基半胱氨酸不敏感的章鱼碱合成酶蛋白的选择)。可取的标记基因可以是一种基因，其编码￠-葡萄糖醛酸酶蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、￠-半乳糖苷酶蛋白、源自Iuc基因的荧光素酶蛋白、源自Iux基因的荧光素酶蛋白、唾液酸酶蛋白、链霉素磷酸转移酶蛋白、胭脂碱合成酶蛋白、章鱼碱合成酶蛋白或氯霉素乙酰转移酶蛋白。用本发明的核酸构建体，植物细胞可稳定地或瞬时地进行转化。在稳定转化中，本发明的核酸分子整合至植物基因组，因而其表现出稳定和遗传的特性。在瞬时转化中，核酸分子通过转化的细胞进行表达，而其没有整合至基因组，因此其表现出瞬时性状。将外源基因引入单子叶植物和双子叶植物有不同的方法(Potrykus,1., Ann.Rev.Plant.Physiol., Plant.Mol.Biol.(1991) 42:205-225 ；Shimamoto 等，Nature (1989)338:274-276)。将外源DNA稳定整合到植物基因组DNA的主要方法包括两个主要途径:(i )农杆菌介导的基因转移:Klee 等(1987) Annu.Rev.Plant Physiol.38:467-486 ;Klee 和 Rogers,Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,Vol.6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, Schell, J.,和 Vasil, L.K., AcademicPublishers, San Diego, Calif.(1989) 2-25 ；Gatenby, in Plant Biotechnology, Kung,S.和 Arntzen，C.J.，Butterworth Publishers, Boston, Mass.(1989) 93-112。(ii )直接的DNA导入:Paszkowski 等，Cell Culture and Somatic Cell Geneticsof Plants, Vol.6 Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, Schell, J.,和 Vasil,L.K.,Academic Publishers, San Diego, Calif.(1989)52-68 ;包括将 DNA 直接导入原生质体中，K.等(1988)Bio/Technology 6:1072-1074.短时植物电休克诱导的DNA导入=Zhang等.Plant Cell Rep.(1988) 7:379-384.Fromm 等 Nature (1986) 319:791-793.通过微粒轰击将 DNA 注入植物细胞或组织，Klein 等 Bio/Technology.(1988)6:559-563 ；McCabe等 Bio/Technology (1988)6:923-926 ；Sanford,Physiol.Plant.(1990)79:206-209 ;通过使用微量移液器系统(micropipette system):Neuhaus 等，Theor.Appl.Genet (1987)75:30-36 ；Neuhaus and Spangenberg, Physiol.Plant.(1990) 79:213-217 ;细胞培养物、胚或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化，美国专利N0.5，464，765或通过用萌发花粉直接孵育 DNA, DeWet 等 Experimental Manipulation of Ovule Tissue, Chapman, G.P.和Mantel I, S.H.和 Daniels, W.Longman, London, (1985) 197-209 ;和 Ohta, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1986) 83:715-719。农杆菌系统包括利用包含整合到植物基因组DNA的定义DNA片段的质粒载体。植物组织接种的方法根据植物种和农杆菌递送系统的不同而不同。广泛使用的方法是叶盘法，其可借助任何可为引发全株分化提供良好来源的组织外植体实施。Horsch等，PlantMolecular Biology Manual A5, Kluwer Academic PubIishe, Dordrecht (1988) 1-9。补充方法采用与真空渗透结合的农杆菌递送系统。农杆菌系统尤其可用于创建转基因双子叶植物。直接将DNA转移至植 物细胞有不同的方法。在电穿孔法中，将原生质体短暂地暴露在强电场中。在微注射中，利用非常小的微量移液器将DNA直接机械地注进细胞。在微粒轰击中，DNA吸附在微弹上，例如硫酸续晶体或鹤颗粒，且微弹物理地加速进入细胞或植物组织中。稳定转化后，开始植物繁殖。植物繁殖的最常用方法是通过种子繁殖。然而，通过种子繁殖的再生过程存在缺陷，这是由于杂合性，使得作物中缺乏一致性，因为根据孟德尔遗传规律的遗传变异，种子由植物产生。本质上，每个种子从遗传学角度而言都是不同的且每个种子都将长成而具有其自己特定的性状。因此，优选产生转化植物使得再生植物具有与亲代转基因植物相同的性状和特征。因此，优选转基因植物通过微繁殖再生，微繁殖使得转化植物快速、一致的繁殖。微繁殖(micropropagation)是从选定的亲代植物或培育品种中切除的单个组织长成新一代植物的过程。该过程可使具有表达融合蛋白的优选组织的植物大量繁殖。产生的新一代植物从遗传学角度与原始植物相同并具有原始植物的所有特性。微繁殖可在短时间内大量繁殖高质量的植物材料并保留原始植物或转化植物的特性，快速繁殖选定的品种。克隆植物的优点在于植物繁殖的速度和所产生植物的品质和一致性。微繁殖是多阶段的过程，其需要变化各阶段间的培养基或培养条件。因此，微繁殖过程包含四个基本阶段；阶段一，初始组织培养；阶段二，组织培养繁殖；阶段三，分化和植物形成；和阶段四，温室培养和炼化(炼苗，hardening)。在阶段一，初始组织培养中，建立组织培养物并确保其无污染。在阶段二中，繁殖起始组织培养物，直到产生的组织样本数目足够满足生产目标。在阶段三中，在阶段二生长的组织样本分裂并生长成单个植物苗。在阶段四中，将转化的植物转移至温室炼化，其中植物耐光性逐渐提高，以便其能在自然环境中生长。虽然目前优选稳定转化，但是本发明还考虑进行叶细胞、分生组织细胞或整个植物的瞬时转化。上述的任何直接DNA转移方法都可实现瞬时转化，或利用修饰的植物病毒，通过病毒感染实现瞬时转化。所示出的用于植物宿主转化的病毒包括CaMV、TMV和BV。利用植物病毒的植物转化的描述见美国专利N0.4，885，237 (BGV)，EP-A 67, 533 (TMV)，日本已公开专利 N0.63-14693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV)；和 Gluzman, Y.等，Communications in Molecular Biology:Viral Vectors, Cold Spring HarborLaboratory,New York, 172-189 (1988)。在许多宿主中，包括植物，用于表达外源DNA的假病毒颗粒的描述见WO 87/06261。植物中用于导入和表达 非病毒外源核酸序列的植物RNA病毒的构建见上述参考以及 Dawson，ff.0.等，Virology (1989) 172:285-292 ；Takamatsu 等，EMBO J.(1987)6:307-311 ;French 等,Science (1986) 231:1294-1297 ;和 Takamatsu 等，FEBS Letters(1990) 269:73-76。当该病毒是DNA病毒时，可对病毒自身作适当修饰。可供选择地，病毒首先克隆至细菌质粒，以便易于与外源DNA构建所需的病毒载体。病毒之后从质粒切离。如果该病毒是DNA病毒，细菌的复制起点连至病毒DNA，其之后通过细菌进行复制。该DNA的转录和翻译将产生可用壳体包裹病毒DNA的衣壳蛋白。如果该病毒是RNA病毒,该病毒一般作为cDNA进行克隆并插入质粒。质粒之后用于进行所有的构建。之后通过转录质粒的病毒序列和病毒基因的翻译产生RNA病毒，从而产生可将病毒DNA包入衣壳内的衣壳蛋白。植物中用于导入和表达非病毒外源核酸序列(例如本发明结构中包括的那些序列)的植物RNA病毒的构建参见上述参考以及美国专利N0.5，316，931。在一个实施例中，提供了植物病毒核酸，其中天然衣壳蛋白编码序列已从病毒核酸缺失，已插入非天然植物病毒衣壳蛋白编码序列和非天然启动子，优选地插入非天然衣壳蛋白编码序列的次基因组(亚基因组，subgenomic)启动子，其能在植物宿主中表达，包装该重组植物病毒核酸并通过该重组的植物病毒核酸使得宿主全身性感染。可供选择地，通过在其内部插入非天然核酸序列可使衣壳蛋白基因失活，从而产生蛋白质。该重组的植物病毒核酸序列可包含一个或更多额外的非天然次基因组启动子。每个非天然次基因组启动子可在植物宿主中转录或表达邻近基因或核酸序列，但不能与彼此和天然次基因组启动子重组。如果包含超过一个核酸序列，非天然(外源)核酸序列可插入邻近的天然植物病毒次基因组启动子或天然和非天然植物病毒次基因组启动子。非天然核酸序列在次基因组启动子的控制下，在宿主植物中进行转录或表达，从而产生所需产物。在第二实施例中，其提供了如同第一实施例中的重组植物病毒核酸，但是其在其中一个非天然衣壳蛋白次基因组启动子的邻近位置安排天然衣壳蛋白编码序列，而不是非天然衣壳蛋白编码序列。
在第三个实施例中，其提供了重组植物病毒核酸，其中天然衣壳蛋白基因邻接其次基因组启动子且一个或更多非天然次基因组启动子已插入病毒核酸。插入的非天然次基因组启动子可在植物宿主中转录或表达邻近基因，但不能与彼此和与天然的次基因组启动子重组。非天然核酸序列可邻近非天然次基因组植物病毒启动子插入，使得序列在次基因组启动子的控制下，在宿主植物中转录或表达，从而产生所需产物。在第四个实施例中，其提供了如同第三个实施例中的重组的植物病毒核酸，但其天然衣壳蛋白编码序列被取代成非天然衣壳蛋白编码序列。病毒载体被重组的植物病毒核酸编码的衣壳蛋白包入衣壳内，以便产生重组的植物病毒。重组的植物病毒核酸或重组的植物病毒用于感染合适的宿主植物。重组的植物病毒核酸可在宿主中复制，系统地蔓延宿主并在宿主中转录或表达外源基因(分离的核酸)，从而产生所需蛋白质。除上述之外，本发明的核酸分子还可导入叶绿体基因组，从而能表达叶绿体。将外源核酸序列导入叶绿体基因组的技术是大家熟知的。该技术包含以下步骤。第一，通过化学方法处理植物细胞，使得每个细胞的叶绿体数目减少至大约一个。然后，通过粒子轰击将外源核酸导入细胞，目标是至少将一个外源核酸分子导入叶绿体。选择外源核酸，以便其通过易受叶绿体固有酶影响的同源重组整合至叶绿体的基因组。为此，外源核酸包括，除感兴趣的基因之外，至少一种源自叶绿体基因组核酸链段(stretch)。此外，外源核酸包括选择性标记物，其通过顺序选择法确定经过该选择后叶绿体基因组的所有或几乎所有拷贝将包括外源核酸。有关该技术的进一步细节见美国专利N0.4，945，050和N0.5，693，507，其以引用的方式并入本文中。叶绿体的蛋白表达系统可因此产生多肽并整合至叶绿体的内膜。预期在源自该应用的专利成熟(patent maturing)期限内，可发展用于转化植物的许多相关技术并且在短语“植物转化”的范围意图包括所有的这些推衍的新技术。
这里使用的术语“大约”指的是±10%。术语“包括” “包含” “具有”意指“包括但不限于”。 术语“由…组成”意指“包括且限于”。术语“基本由…组成”意指组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤和/或部分，但仅适用于额外的成分、步骤和/或部分不显著改变所要求组合物、方法或结构的基本和新颖特性的情况。这里使用的术语“方法”指的是用于完成指定任务的方式、手段、技术和步骤，其包括，但不限于，那些化学、药理、生物、生物化学和医学领域内的从业人员所熟知的或容易通过已知方式、手段、技术和步骤进行改进的方式、手段、技术和步骤。应该理解，为清楚起见，描述于独立实施例中的本发明的某些特性也可在单个实施例中以结合形式提供。相反地，为简便起见，在单个实施例中描述的本发明的不同特性也可单独存在或以任何合适的变型形式存在或同样适合于任何其他描述的本发明实施例。在不同实施例中描述的某些特征不被认为那些实施例的基本特性，除非实施例在不具备那些要素时是无效的。如上述的和权利要求部分所限定的本发明的不同实施例和方面可在下面实例中得到试验性支持。
实例现引用下面实例，结合以上描述以非限制性方式说明本发明的一些实施例。一般地，这里使用的术语和本发明中所用的实验步骤包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分说明。例如，见“Molecular Cloning:Alaboratory Manual，，Sambrook 等，(1989) ;“Current Protocols in Molecular”1-UI 卷Ausubel, R.M.，(1994) ；Ausubel 等“Current Protocols in Molecular”，John Wiley 和Sons,Baltimore,MarylandC1989)；Perbal,uA Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons,New York( 1988);Watson 等，“Recombinant DNAScientific AmericanBooks, New York ;Birren 等(eds) “Genome Analysis:A Laboratory Manual Series，，，Vols 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);方法如美国专利N0.4，666，828 ；N0.4，683，202 ；N0.4，801，531，N0.5，192，659 和 N0.5，272，057 中描述;“Cell Biology:A Laboratory Handbook”，1-UI 卷 Cellis，J.E.eds (1994);“Cultureof Animal Cells-A Manual of Basic Technique，，Freshney，Wiley-Liss, N.Y.(1994)，第三版；“Current Protocols in Immunology”1-UI 卷 Coligan J.E.(1994) ；Stites等(eds)，“Basic and Clinical Immunology，，(第八片反)，Appleton&Lange，Norwalk，CT (1994) ；Mishell 和 Shiigi (eds)，“Selected Methods in Cellular Immunology，，，W.H.Freeman和C0.，New York (1980);可利用的免疫测定法广泛描述于专利和科学文献中，例如，见美国专 利 N0.3，791，932 ；N0.3，839，153 ；N0.3，850，752 ；N0.3，850，578 ；N0.3，853，987 ；N0.3，867，517 ；N0.3，879，262 ；N0.3，901，654 ；N0.3，935，074 ；N0.3，984，533 ；N0.3，996，345 ；N0.4，034，074 ；N0.4，098，876 ；N0.4，879，219 ；N0.5，011，771 和 N0.5，281，521 ,Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.(1984)；“Nucleic Acid HybridizationnHames,B.D.和Higgins S.J.(1985);‘‘Transcription andTranslation，，Hames，B.D.和 Higgins S.J.(1984) Animal Cell Culture，，Freshney，R.1.(1986) ;“Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press，( 1986) ;“A PracticalGuide to Molecular Cloning”Perbal，B.，( 1984)和“Methods in Enzymology” 1-317 卷，Academic Press ;‘‘PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications”，AcademicPress，San Diego, CA (1990) ;Marshak 等，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manua，，CSHL Press (1996);其全部都以引用的方式并入本文中。本文还提供其他一般参考文献。其中的方法为本领域内众所周知的方法并且提供这些方法为了方便读者理解。这里包含的所有信息都以引用的方式并入本文。实例I橙色甜瓜(orange melon)的化学诱变材料和方法化学诱变:将‘夏朗德(Charentais)’甜瓜种子暴露于1%甲磺酸乙酯(EMS)中12小时。种植处理后的种子(M1)并通过自花传粉得到M2家系。结果分离其中一个家系CEM 3285，其具有隐性的改变的橙色(图2)。突变果实(CEM 3285)中类胡萝卜素的HPLC分析显示了相比野生型改变的类胡萝卜素图谱。突变果实中主要的类胡萝卜素为四-顺式-番茄红素(前番茄红素)，而野生型果实累积￠-胡萝卜素作为主要色素(图3)。所分析的M2植物的四分之一结的是指示该性状的单基因隐性遗传的突变果实。-CEM 3285果实的HPLC色谱类似橘黄色西红柿和累积前番茄红素的西瓜的类胡萝卜素图谱。研究发现针对灰白色幼苗(图4)分离(segregate)的CEM 3285具有隐性的单基因性状。灰白色组织在暴露于光时，开始累积叶绿素。进一步研究发现植物的自花传粉所结果实的种子可产生前番茄红素，其生长成灰白色幼苗(图5)且其植物累积前番茄红素作为其主要的果实类胡萝卜素。对累积前番茄红素稳定化的品系的花(用于突变的纯合子)具有改变的浅黄色花瓣，相比野生型的深黄色花瓣(图6)，其橙色具有一点细微差别。相对于野生型的绿色(图7)，突变表型的子房内部为橙黄色。实例2 分析提取自CEM 3285突变体的DNA材料和方法CEM 3285突变体中核酸的提取:利用CTAB方法分离出整个基因组DNA。
利用SIGMA 的‘GenElute Mammalian Total RNA Miniprep’试剂盒提取信使 RNA。借助THERMO的‘Verso cDNA’试剂盒完成mRNA到cDNA的转化。根据甜瓜和西瓜中公布的(www.worldwideweb.1cug1.0rg)和未公布的CRTISO序列，借助GENERUNNER (v 3.05 Hastings软件)选择引物。利用D4309Sigma REDTaq _ DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。甜瓜类胡萝卜素异构酶(CRTISO)的测序:借助Applied Biosystems 的 3130xlGENETIC ANALYZER,根据制造商提供的方法进行CRTISO的测序。qRT-PCR 分析:借助ABI Prism7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems,Foster, CA)进行实时 PCR 分析。利用 ABsoluteTMQPCR SYBR_ GreenMixes (ABgene _'s Inc., Epsom, UK)进行扩增。使用下面引物序列(最终浓度0.2 ii m): (I)亲环蛋白(一种看家基因，登录号 DV632830)正向引物 5 ' -GATGGAGCTCTACGCCGATGTC-3 '(SEQ ID NO:9)和反向 5 ' -CCTCCCTGGCACATGAAATTAG-3 ' (SEQ ID NO: 10);CRITIS0 正向引物 5 ' -AGGGGACTGGTTGATCATGG-3 ' (SEQ ID NO:11)和反向5' -GCACAAAATGGTGACAATCTGT-3' (SEQ ID NO: 12)。结果对提取自CEM 3285突变体的DNA中的基因组CRITIS0进行测序且将其与野生型和另外的甜瓜品系中的序列进行比较。所有的野生品系具有相同的序列，表明该基因是高度保守的。观察到在1554位置(cDNA的634位置；从ATG起始计算)发生A到T碱基转换，导致在翻译后从赖氨酸转换至终止密码子(AAG — TAG)。碱基转换发生于第七个外显子(图8)的第四个碱基。由于诱导突变接近内含子-外显子连接(交界，junction)处，其还导致该基因错误剪接，使得表达了两个CRTISO转录本，一个具有野生型大小，另一个缺失五个碱基，通过提取自发育果实的mRNA的PCR扩增(图9)可得到证实。突变的mRNA当转录全长mRNA时，导致产生未成熟终止密码子以及由于五个碱基对的缺失导致移码突变，其导致未成熟的终止密码子和氨基酸的改变(图10A-10C)。发育的果实和叶片的qRT-PCR分析表明突变叶片和果实中的CRTISO转录水平显著较低(图11)。虽然结合具体实施例描述了本发明，但是许多改变、修改和变化对本领域内的技术人员是显而易见的。相应地，全部的这些改变、修改和变化都包含在所附权利要求限定的精神和广泛的保护范围内。将本说明书中提到的所有的公开、专利和专利申请的全部内容并入本说明书中作为参考，其程度等同于具体和单独地表明每个单独的公布、专利和专利申请都以参考的形式并入本文。另外，本申请中任何参考文献的引用和识别都不解释为承认这些参考文献可作为本发明的现有技术。就所使用`的章节标题而言，其不必解读为必然限制性的。
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权利要求
1.一种甜瓜植物，其中所述植物的果实的果肉包含四-顺式-番茄红素(前番茄红素)。
2.根据权利要求1中所述的植物，其中所述植物的所述果实的所述果肉包含比￠-胡萝卜素更多量的四-顺式-番茄红素(前番茄红素)。
3.根据权利要求1中所述的植物，其具有基因组，所述基因组包含至少一个具有功能失活突变的CRTISO的等位基因。
4.根据权利要求1中所述的植物,其包含核酸构建体,所述核酸构建体包含编码下调CRTISO表达的多聚核苷酸因子的核酸序列和能够指导所述多聚核苷酸因子在所述植物中表达的顺式作用调控元件。
5.根据权利要求4中所述的植物，其中所述多聚核苷酸因子为SiRNA或核酶。
6.一种甜瓜植物，其具有基因组，所述基因组包含至少一个具有功能失活突变的CRTISO的等位基因。
7.根据权利要求6中所述的植物，其中所述植物的果实的果肉包含前番茄红素。
8.根据权利要求7中所述的植物，其中所述植物的所述果实的所述果肉包含比￠-胡萝卜素更多量的四-顺式-·番茄红素(前番茄红素)。
9.根据权利要求1或6中所述的植物，其缺乏类胡萝卜素异构酶催化活性。
10.根据权利要求3或6中所述的植物，其中所述CRTISO的每个等位基因携带至少一个功能失活突变。
11.根据权利要求9中所述的植物，其中所述CRTISO为纯合形式。
12.根据权利要求9中所述的植物，其中所述CRTISO为杂合形式。
13.根据权利要求1或6中所述的植物，其中所述植物为稳定的亲本品系。
14.根据权利要求1或6中所述的植物，其中所述植物是通过将两个亲本品系杂交而生成的杂种。
15.一种源自权利要求1或6中所述植物的种子。
16.一种源自权利要求1或6中所述植物的果实。
17.一种源自权利要求1或6中所述植物的花粉。
18.一种源自权利要求1或6中所述植物的胚珠。
19.一种源自权利要求1或6中所述植物的细胞。
20.一种包含权利要求19中所述细胞的细胞培养物。
21.根据权利要求1或6中所述的植物，进一步包含额外性状，所述额外性状由以下构成:抗除草剂性、抗虫性、对细菌、真菌或病毒性疾病的抗性、雄性不育以及提高的营养价值。
22.根据权利要求1或6中所述的植物，进一步包含额外性状，所述额外性状选自至少一种类型的疾病抗性和至少一种类型的胁迫抗性。
23.一种用于产生杂种甜瓜种子的方法，包括将第一亲本甜瓜植物与第二亲本甜瓜植物杂交并收获得到的杂种F1种子，其中第一或第二亲本甜瓜植物中的至少一个是权利要求1或6中所述的植物。
24.一种通过权利要求23中所述的方法产生的杂种甜瓜种子。
25.—种通过培育权利要求24中所述的杂种甜瓜种子而产生的杂种甜瓜植物、或其部分。
26.—种通过培育权利要求25中所述的杂种甜瓜植物而产生的种子。
27.一种生成权利要求1中所述的植物的方法，所述方法包括下调甜瓜植物中的类胡萝卜素异构酶(CRTISO)的量和/或活性，从而生成所述植物。
28.根据权利要求27中所述的方法，其中通过化学诱变实现所述下调。
29.根据权利要求27中所述的方法，其中通过向甜瓜植物中导入核酸构建体来实现所述下调，所述核酸构建体包括编码下调所述CRTISO表达的多聚核苷酸因子的核酸序列和能够指导所述多聚核苷酸因子在所述植物中表达的顺式作用调控元件。
30.根据权利要求29中所述的方法，其中所述多聚核苷酸因子为SiRNA或核酶。
31.一种产生甜瓜果实的方法，所述甜瓜果实的果肉包含比￠-胡萝卜素更多量的四-顺式-番茄红素(前番茄红素)和/或所述甜瓜果实具有至少一个具有功能失活突变的CRTISO的等位基因，所述方法包括: Ca)播种所述甜瓜果实的种子，和/或栽培所述种子的幼苗； (b)培育由所述种子或所述幼苗生长的植物；以及 (c)收获所述植物的甜瓜果实，从而产生所述甜瓜果实。
32.一种甜瓜品系CEM 3285的种子，其种子的样品已保藏于NCMB，保藏号为41710。
33.一种甜瓜品系CEM 3285的植物，其种子的样品已保藏于NCMB，保藏号为41710。
全文摘要
公开了一种甜瓜植物，其中该植物的果实的果肉包含四-顺式-番茄红素(前番茄红素)。还公开了产生所述植物的方法。
文档编号A01H5/00GK103079399SQ201180020374
公开日2013年5月1日 申请日期2011年2月22日 优先权日2010年2月22日
发明者雅各布·塔德莫尔, 优素福·布格尔, 尼里·卡齐尔, 埃夫拉伊姆·莱温松, 维塔利·波特努瓦, 塔马·拉维, 阿亚拉·梅尔, 乌齐·萨尔, 阿瑟·A·沙费尔 申请人:以色列国家农业和农村部农业研究组织(A.R.O.)，沃尔卡尼中心