专利名称：五节芒多倍体诱导方法
技术领域：
本发明属于植物细胞工程领域，涉及植物组织工程技术，具体地说是一种五节芒的多倍体诱导方法。
背景技术：
五节芒(MiscanthusfIoridulus)属于禾本科(Poaceae)芒属(Miscan thus Andersson)(陈守良，1997)，是一种高光效的C4植物，具有生物质产量高、抗逆性强、纤维素含量高、燃烧充分等特点，被认为是一种开发潜力巨大的生物质能源植物，在我国主要分布在热带和亚热带地区。目前，五节芒多倍体诱导方面的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种五节芒的多倍体诱导方法。五节芒多倍体诱导方法，包括如下步骤I)外植体的选择与灭菌选用五节芒种子，在无菌操作台上用70%酒精处理，再用O. I %的升汞消毒,最后用无菌水冲洗备用；2)胚性愈伤组织的诱导和分化将灭菌处理后种子，在超净台接种在愈伤组织诱导培养基MS+2-5mg/L 2，4_D ;暗培养，保持温度24±2°C诱导愈伤组织(7天左右产生愈伤组织)，然后将愈伤组织接种在分化培养基MS+l-2mg/L6-BA中，分化条件为温度24 ± 2 °C， 光照 2000Iux ；3)秋水仙素的处理将秋水仙素过滤灭菌，将分化后带芽点的愈伤组织接种于添加质量百分比O. 05% -O. 2%的秋水仙素的基本培养基中，处理24h-72h ;(在试验的几个处理中，以秋水仙素O. 1%处理72h诱导率最高)4)丛生芽诱导或增殖将材料从秋水仙素处理培养基中取出，无菌水清洗，用灭菌过的滤纸吸干残留水分；转入分化增殖生根培养基MS+2mg/L6-BA+0. 2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。多倍体鉴定在植株根长达l_2cm左右时，切取6_10mm根尖，进行染色体核型鉴定；染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。步骤I)中选用五节芒种子，在无菌操作台上用70%酒精处理15-30秒，再用 O. I %的升萊消毒10 15分钟,用无菌水冲洗6 7次备用。步骤2)中50ml三角瓶内每瓶接种15-20颗种子。步骤2)中，当愈伤组织长至直径为O. 5-0. 8cm后进行分化，分化获得带芽点的愈伤组织或丛生芽；选取带芽点的愈伤组织进行秋水仙素的处理。步骤2)中挑选淡黄色并致密的愈伤组织，接种在分化培养基中。步骤3)中所述的基本培养基为MS+0. 3%蔗糖+0. 7%琼脂。步骤3)中优选将分化后带芽点的愈伤组织接种于添加质量百分比为O. 1%-0. 2%的秋水仙素的基本培养基中， 处理 24h-72h。
步骤4)中将材料从秋水仙素处理培养基中取出，用灭菌过的滤纸吸干残留液后， 无菌水清洗3次，每次1-3分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留水分。本发明提出的五节芒多倍体诱导方法，利用五节芒种子为外植体，取材不受季节限制，通过愈伤诱导，秋水仙素诱变，愈伤组织分化成苗，多倍体鉴定，最终得到多倍体材料，周期2-3个月，与常规育种相比，诱变时间大大缩短，为五节芒新品种选育提供了一条新途径。
图I为实施例I五节芒(M. floridulus) 02117 (2n)的核型图；图2为实施例I五节芒(M. floridulus) 02117 (4n)的核型图。
具体实施例方式以下结合实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。实施例I取材五节芒(M. floridulus) 02117，采集自湖南郴州，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。I、外植体的选择与灭菌选用五节芒(M. floridulus)饱满完整种子,在无菌操作台上用70%酒精处理15秒左右,再用O. I %的升汞消毒10分钟,用无菌水冲洗6次备用；2、胚性愈伤组织的诱导将灭菌处理后种子，在超净台接种在愈伤组织诱导培养基MS+2mg/L2，4-D ；50ml接种瓶内每瓶接种20颗种子，暗培养，保持温度24±2°C，7天左右产生愈伤组织；愈伤组织生长至直径为O. 5-0. 8cm，挑选淡黄色并较为致密的愈伤组织， 接种在分化培养基为MS+lmg/L6-BA，分化条件为温度24±2°C，光照20001ux。3、秋水仙素的处理将秋水仙素过滤灭菌，将带芽点的愈伤组织接种于添加 O. 05%秋水仙素的基本培养基(MS+0. 3%蔗糖+0. 7%琼脂)中，处理24h、48h、72h，各设3 次重复。4、丛生芽诱导或增殖将材料从秋水仙素处理培养基中取出，用灭菌过的滤纸吸干残留液后，转入灭了菌的三角瓶，加入无菌水，清洗3次，I次1-3分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留水分；将带芽点的愈伤组织转入分化增殖生根培养基MS+2mg/ L6-BA+0. 2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。5、多倍体鉴定在植株根长达l_2cm左右时，切取6-10mm根尖，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。结果表明，随着处理时间的延长愈伤组织死亡率提高，多倍体诱导率提高，嵌合体数目下降。表102117带芽点愈伤组织秋水仙素诱变效果秋水仙素处理时间处理愈伤组死亡率嵌合体
的浓度(％) (h)织数(块)(％)诱导率(％)(株)0.0524 50386. 710 0.0548 5043115 0.0572 5058253实施例2取材五节芒(M. floridulus) 04036，采集自陕西勉县，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。I、外植体的选择与灭菌选用五节芒(M. floridulus)饱满完整种子,在无菌操作台上用70%酒精处理20秒左右,再用O. I %的升汞消毒12分钟,用无菌水冲洗7次备用；2、胚性愈伤组织的诱导将灭菌处理后种子，在超净台接种在愈伤组织诱导培养基MS+4mg/L2，4-D ；50ml接种瓶内每瓶接种15颗种子，暗培养，保持温度24±2°C，7天左右产生愈伤组织；愈伤组织生长至直径为O. 5-0. 8cm，挑选淡黄色并较为致密的愈伤组织， 接种在分化培养基为MS+1. 5mg/L6-BA，分化条件为温度24±2°C，光照20001ux。3、秋水仙素的处理将秋水仙素过滤灭菌，将带芽点的愈伤组织接种于添加 O. 1%秋水仙素的基本培养基(MS+0. 3%蔗糖+0. 7%琼脂)中，处理24h、48h、72h，各设3次重复。4、丛生芽诱导或增殖将材料从秋水仙素处理培养基中取出，用灭菌过的滤纸吸干残留液后，转入灭了菌的三角瓶，加入无菌水，清洗3次，I次1-3分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留水分；将带芽点的愈伤组织转入分化增殖生根培养基MS+2mg/ L6-BA+0. 2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。5、多倍体鉴定在植株根长达l_2cm左右时，切取6-10mm根尖，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。结果表明，随着处理时间的延长愈伤组织死亡率提高，多倍体诱导率提高。表204036带芽点愈伤组织秋水仙素诱变效果
秋水仙素处理时间~处理愈伤组死亡率嵌合体
的浓度(％)(h) 织数(块)(％) 诱导率(％) (株)O. I24 505620O O. I48 505825 O O. I72 505938 O实施例3取材五节芒(M. floridulus) 06023，采集自广西贺州，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。I、外植体的选择与灭菌选用五节芒(M. floridulus)饱满完整种子,在无菌操作台上用70%酒精处理30秒左右,再用O. I %的升汞消毒12分钟,用无菌水冲洗7次备用；2、胚性愈伤组织的诱导将灭菌处理后种子，在超净台接种在愈伤组织诱导培养基MS+3mg/L2，4-D ；50ml接种瓶内每瓶接种15颗种子，暗培养，保持温度24±2°C，7天左
5右产生愈伤组织；愈伤组织生长至直径为O. 5-0. 8cm，挑选淡黄色并较为致密的愈伤组织， 接种在分化培养基为MS+2mg/L6-BA，分化条件为温度24±2°C，光照20001ux。3、秋水仙素的处理将秋水仙素过滤灭菌，将带芽点的愈伤组织接种于添加 O. 15%秋水仙素的基本培养基(MS+0. 3%蔗糖+0. 7%琼脂)中，处理24h、48h、72h，各设3
次重复。4、丛生芽诱导或增殖将材料从秋水仙素处理培养基中取出，用灭菌过的滤纸吸干残留液后，转入灭了菌的三角瓶，加入无菌水，清洗3次，I次1-3分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留水分；将带芽点的愈伤组织转入分化增殖生根培养基MS+2mg/ L6-BA+0. 2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。5、多倍体鉴定在植株根长达l_2cm左右时，切取6-10mm根尖，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。结果表明，随着处理时间的延长愈伤组织死亡率提高，多倍体诱导率提高。表306023带芽点愈伤组织秋水仙素诱变效果
权利要求
1.五节芒多倍体诱导方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)外植体的选择与灭菌选用五节芒种子，在无菌操作台上用70%酒精处理，再用0.I %的升汞消毒,最后用无菌水冲洗备用；2)胚性愈伤组织的诱导和分化将灭菌处理后种子，在超净台接种在愈伤组织诱导培养基MS+2-5mg/L2，4-D ;暗培养，保持温度24±2°C诱导愈伤组织，然后将愈伤组织接种在分化培养基MS+l-2mg/L6-BA中，分化条件为温度24±2°C，光照20001ux ；3)秋水仙素的处理将秋水仙素过滤灭菌，将分化后带芽点的愈伤组织接种于添加质量百分比为0. 05% -0. 2%的秋水仙素的基本培养基中，处理24h-72h ；4)丛生芽诱导或增殖将材料从秋水仙素处理培养基中取出，无菌水清洗，用灭菌过的滤纸吸干残留水分；转入分化增殖生根培养基MS+2mg/L6-BA+0. 2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。
2.根据权利要求I所述的诱导方法，其特征在于，步骤I)中选用五节芒种子，在无菌操作台上用70%酒精处理15-30秒，再用0. 1%的升汞消毒10 15分钟，用无菌水冲洗6 7次备用。
3.根据权利要求I所述的诱导方法，其特征在于，步骤2)中50ml三角瓶内每瓶接种15-20颗种子。
4.根据权利要求I所述的诱导方法，其特征在于，步骤2)中，当愈伤组织长至直径为0. 5-0. 8cm后进行分化，分化获得带芽点的愈伤组织或丛生芽；选取带芽点的愈伤组织进行秋水仙素的处理。
5.根据权利要求I或4所述的诱导方法，其特征在于，步骤2)中挑选淡黄色并致密的愈伤组织，接种在分化培养基中。
6.根据权利要求I所述的诱导方法，其特征在于，步骤3)中所述的基本培养基为MS+0. 3%蔗糖+0. 7%琼脂。
7.根据权利要求I所述的诱导方法，其特征在于，步骤3)中将分化后带芽点的愈伤组织接种于添加质量百分比为0. 1% -0. 2%的秋水仙素的基本培养基中，处理24h-72h。
8.根据权利要求I所述的诱导方法，其特征在于，步骤4)中将材料从秋水仙素处理培养基中取出，用灭菌过的滤纸吸干残留液后，无菌水清洗3次，每次1-3分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留水分。
全文摘要
本发明公开了一种五节芒多倍体诱导方法，以五节芒的种子为外植体，诱导获得胚性愈伤组织之后，对带芽点的愈伤组织进行多倍体诱变，0.1％秋水仙素处理愈伤组织72h左右，可诱导获得四倍体再生植株，低浓度的秋水仙素不能产生加倍效应，高浓度会导致愈伤组织死亡或严重抑制愈伤组织再生能力。本发明提出的五节芒多倍体诱导方法，利用五节芒种子为外植体，取材不受季节限制，通过愈伤诱导，秋水仙素诱变，愈伤组织分化成苗，经过鉴定，最终得到多倍体材料，周期2-3个月，与常规育种相比，诱变时间大大缩短，为五节芒新品种选育提供了一条新途径。
文档编号A01H4/00GK102577982SQ20121008021
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者刘清波, 易自力, 肖亮, 蒋建雄, 陈智勇 申请人:湖南农业大学