专利名称：一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治核桃炭疽病方面的应用的制作方法
一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治核桃炭疸病方面的应用技术领域
本发明属于微生物应用领域。具体而言，本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其用途。
背景技术：
炭疽病是危害核桃产业健康发展的重要病害之一。世界各核桃产区均有发生。 主要危害果实、叶片、幼树、嫩梢和芽，潜伏期长、发病时间短、爆发性强，一般病果率达 20 40%，严重者高达80%以上，落果率达50%以上。在收果前l(T20d迅速使果实发黑变烂， 严重影响核桃产量和品质，造成严重的经济损失。
对于该病的防治，国外根据种植区、种植目的不同使用药剂不同。苗圃和绿地以 Banner MAXX、代森锰锌、波尔多液为主，人工林以多果定(Dodine)为主，多果定是目前唯一一个登记注册的可以用在可食坚果树上防治炭疽病的杀菌剂。国内防治炭疽病比较粗放，主要以退津特、甲基托布津、百菌清、波尔多液、仲丁胺、霉疫净为主。长期使用化学杀菌剂，导致病菌抗药性增强，只有加大用药剂量以控制病害，从而增加了生产成本和农药残留量。核桃一般种植在山区、丘陵，大多数是水分涵养区域，如果大量使用化学农药，极易污染土壤，水分，对城市及当地用水也是极大的风险。因此对核桃炭疽病进行生物防治是必然趋势。利用拮抗微生物防治核桃病害有望成为代替化学药剂的一种安全、无毒及有效的新方法。拮抗微生物不仅可以防病，而且还能促进植物生长，对改善林地生态系统，保持林间生物多样性，以及维护林田生态平衡实现林业可持续发展将起到重要作用。全球生物农药的产量以每年10%-20%的速度递增。目前，全世界生物农药产品已经超过100多种，其中90% 是微生物杀虫剂，微生物杀菌剂相对较少。尤其是利用解淀粉芽孢杆菌防治核桃炭疽病还未见报道。发明内容
本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌菌株SDF-005，它可以用作生物农药，用来防治核桃炭疽病，具有良好的应用前景。
本发明的另一个目的是提供一种采用解淀粉芽孢杆菌SDF-005制备的发酵液和菌剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的
本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株 SDF-005，所述菌株的保藏编号为CGMCC No. 6672。
本发明所提供的菌株为解淀粉芽孢杆菌SDF-005，是从山东省济南市南部山区核桃林根际土壤中，采用稀释分离法分离获得的，已于2012年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No. 6672。其具有以下微生物学特性菌体杆状，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，兼性厌氧。NA培养基培养菌落圆形，平展，乳白色，表面不规则，中间有3圆环形突起，边缘整齐。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。该菌株的16S rRNA基因序列测定结果如SEQ-I所示，该菌株的atpA基因序列测定结果如SEQ-2所示。
本发明提供了解淀粉芽孢杆菌SDF-005的培养方法或繁殖方法普通培养采用NA 培养基保存，实验室液体培养采用NYBD液体培养基。所述NA培养基配方蛋白胨10g、牛肉膏3g、琼脂15g，蒸馏水IOOOmL ；NYBD配方牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠5g，水lOOOmL，pH 7. 3。大量发酵培养配方(重量百分含量)黄豆粉3. 0%，玉米粉3. 0%， 轻质碳酸钙O. 2%，氯化钠O. 1%，其余为水，pH 7. 5。
另一方面，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌SDF-005可湿性粉剂，它由下述重量份的原料制成，解淀粉芽孢杆菌SDF-005菌粉1-30、白炭黑1-60、葡萄糖0. 5_60、淀粉0.5-30、羧甲基纤维素0. 02-10、湿润剂10040. 5_30、分散剂NNO 0. 5_20，所述可湿性粉剂中解淀粉芽孢杆菌SDF-005含量为0. 1-100亿活菌/g。将上述原料混合均匀，控制加工温度0-50°C，在气流粉碎机或其它高目粉碎机，粉碎到150筛目以上水分控制在6-8% (质量百分含量)，PH控制在7-7.5。
所述解淀粉芽孢杆菌SDF-005发酵液和菌粉通过包括以下步骤的方法制得
(I)将保存的解淀粉芽孢杆菌SDF-005转移至NA试管斜面中，置于培养箱26°C恒温培养2-3d ；
(2)在无菌条件下，将培养好的解淀粉芽孢杆菌SDF-005用无菌水以体积比1:10 稀释，吸取lmL，置于NYBD液体培养基中，28°C摇床振荡培养f 2d得到种子液；
(3)按3. 0%比例(体积比)将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度26°C，培养时间36h，通风比I :0. 8。发酵完成后得到发酵液，发酵液菌数可达80亿/g。
(4)将解淀粉芽孢杆菌发酵液与基质(选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种)进行混合均匀，干燥，经干燥后发酵液菌数可达220亿/g。所述发酵液与发酵液基质的质量比为1:8 10。
该微生物菌剂可以用作生物农药，用于防治核桃炭疽病。因此，又一方面，本发明提供解淀粉芽孢杆菌SDF-005或者其发酵液或者本发明的菌剂用于防治核桃炭疽病中的用途。
本发明还提供一种用于防治核桃炭疽病的方法，所述方法包括向具有炭疽病的核桃施用解淀粉芽孢杆菌SDF-005或者其发酵液或者根据本发明的菌剂。
本发明还提供一种用于促进植物生长的方法，所述方法包括向植物施用解淀粉芽孢杆菌SDF-005或者其发酵液或者本发明的菌剂。
实验表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌SDF-005具有菌株新颖、高效、活体菌含量高的特点，其可湿性粉剂防治核桃炭疽病效果显著，防治效果达到78. 22%，且核桃生长健壮， 无药害产生。同时具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少化学农药的使用，因而在生物防治核桃炭疽病中具有重要应用前景。
图I为以16SrDNA序列为基础的SDF-005菌系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例I 解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) SDF-005 (CGMCC No. 6672)的分离与鉴定
I.分离
本发明的解淀粉芽孢杆菌是从山东省济南市南部山区核桃林根际土壤中采用土壤稀释分离法分离获得的，分离方法为
(I) 土样采集从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗筛，取25g作分离用；
(2)培养基平板制备将NA培养基(营养琼脂培养基)和PDA (马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成NA和PDA平板；
(3)称取Ig 土样于灭菌试管中，加IOOmL无菌水，振荡，制成10_2 土壤悬浮液，静置5min，按10倍梯度稀释到10_7 ；
(4)取上述土壤悬浮液O. 5mL,加到培养基平板上，用弯玻棒涂匀。置于培养箱 26 °C恒温培养5-7d。
(5)将单个菌落在NA培养基上划线，得到单菌落，转移至NA试管斜面培养基中，至 26 °C恒温培养。
(6)以核桃炭疽病菌为靶标菌，采用对峙培养法，筛选到一株对核桃炭疽病菌具有较强抑制活性的菌株，编号SDF-005。
所述NA培养基配方为蛋白胨10g、牛肉膏3g、琼脂15g，蒸馏水lOOOmL，pH7. 3 ;所述PDA培养基配方为马铃薯(去皮切块)200g,葡萄糖20g，琼脂14g，蒸馏水1000mL。
2.菌株鉴定
(I)微生物学特性SDF-005菌株杆状、具周生鞭毛，长为6-11 μ m，宽0. 9-1. 6 μ m，革兰氏染色阳性。菌株在NA和NB培养基上28°C培养48h后，菌落圆形，平展，呈乳白色， 表面不规则，中间有圆环形突起，边缘不整齐，不产色素。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。菌株表现菌株好氧生长。
供试菌株SDF-005在所处理的各种温度下，均可正常生长；强酸、强碱环境不适宜该菌株生长，pH5 9条件下，菌株可以正常生长；NaCl浓度在2% 10%之间，菌株生长性状一致。氧化酶阳性，硝酸盐还原试验弱阳性，能利用柠檬酸盐，能产生尿素酶分解尿素，不产H2S, VP试验阳性，能利用苦杏仁甘、ZT，其它特性见下表I :
表1SDF-005菌株的生理生化特性
权利要求
1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株SDF-005,所述菌株的保藏编号为 CGMCC No. 6672。
2.权利要求I所述的解淀粉芽孢杆菌菌株SDF-005在防治核桃炭疽病方面的用途。
3.一种包含权利要求I所述解淀粉芽孢杆菌菌株SDF-005的菌剂。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征是，所述菌剂为可湿性粉剂。
5.如权利要求4所述的菌剂，其特征是，所述可湿性粉剂由下述重量份的原料制成，解淀粉芽孢杆菌SDF-005菌粉1-30、白炭黑1-60、葡萄糖O. 5_60、淀粉O. 5_30、羧甲基纤维素O. 02-10、湿润剂1004 O. 5-30、分散剂NNO O. 5_20，所述可湿性粉剂中解淀粉芽孢杆菌SDF-005含量为O. 1-100亿活菌/g。
6.如权利要求5所述的菌剂，其特征是，所述解淀粉芽孢杆菌SDF-005菌粉由下述方法制成， Cl)将解淀粉芽孢杆菌SDF-005转移至NA试管斜面中，置于培养箱26°C恒温培养2-3d ； (2)在无菌条件下，将培养好的解淀粉芽孢杆菌SDF-005用无菌水以体积比1:10稀释，吸取lmL，置于NYBD液体培养基中，28°C摇床振荡培养f 2d得到种子液； (3)按3.0%的体积比将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度26°C，培养时间36h，通风比I :0. 8 ;所述大量发酵培养基按重量百分比计为黄豆粉3. 0%，玉米粉3. 0%，轻质碳酸钙O. 2%，氯化钠O. 1%，其余为水，pH 7. 5 ； (4)将解淀粉芽孢杆菌发酵液与基质进行混合均匀，干燥；所述发酵液与发酵液基质的质量比为1:8 10。
7.如权利要求6所述的菌剂，其特征是，所述NA培养基为蛋白胨10g、牛肉膏3g、琼脂15g，蒸馏水IOOOmL ;所述NYBD培养基为牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠5g,水 IOOOmL, pH 7. 3。
8.如权利要求6所述的菌剂，其特征是，所述基质选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种。
9.权利要求3-8中任意一项所述的菌剂在防治核桃炭疽病方面的用途。
10.一种用于防治核桃炭疽病的方法，其特征是，向具有炭疽病的核桃施用权利要求I的解淀粉芽孢杆菌SDF-005或者其发酵液或者权利要求3-8中任意一项所述的菌剂。
全文摘要
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治核桃炭疽病方面的应用。该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株SDF-005，保藏编号为CGMCC No.6672。该菌株或者用它制备的发酵液或者用它制备的菌剂可以用作生物农药，用于防治核桃炭疽病。实验表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌SDF-005具有菌株新颖、高效、活体菌含量高的特点，其可湿性粉剂防治核桃炭疽病效果显著，防治效果达到78.22%，且核桃生长健壮，无药害产生。
文档编号A01N63/02GK102925386SQ20121041075
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者牛赡光, 王清海, 刘幸红, 段春华 申请人:山东省林业科学研究院