从微生物生物质中获取含脂质组合物的方法

从微生物生物质中获取含脂质组合物的方法
【专利摘要】本发明提供了粒化微生物生物质、在超临界条件下从所述粒状生物质中提取精制的脂质组合物并在短程蒸馏条件下蒸馏所述精制的脂质组合物至少一次以获取含脂质级份的方法。本发明也公开了通过酯交换并富集含脂质级份制备含脂质的油浓缩物的方法。
【专利说明】从微生物生物质中获取含脂质组合物的方法
[0001]本申请要求提交于2011年2月11日的美国临时申请61/441，836、提交于2011年2月11日的美国临时申请61/441，842、提交于2011年2月11日的美国临时申请61/441，849、提交于2011年2月11日的美国临时申请61/441，854、和提交于2011年5月17日的美国临时申请61/487，019的权益，它们全文以引用方式并入本文。
【技术领域】
[0002]本发明涉及从微生物生物质中获取含脂质级份的方法。具体地，提供了粒化微生物生物质、从粒状生物质中提取提取油并在短程蒸馏条件下蒸馏提取油至少一次以获取含脂质级份的方法。可进一步富集这种含脂质级份。
【背景技术】
[0003]微生物如丝状真菌、酵母和藻类产生多种脂质，包括脂肪酰、甘油脂、磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮化合物、留醇脂和孕烯醇酮脂类。从其中产生这些脂质、并且从而已经实施多种方法的微生物细胞中提取这些脂质中的一些是有利的。
[0004]通常从微生物中提取的一类脂质是甘油脂，包括脂肪酸甘油酯(“三酰基甘油”或“TAG”)。TAG是主要的脂肪酸储存单元，并且从而可含有长链多不饱和脂肪酸(PUFA)，以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸与较长链的饱和脂肪酸。对在药物和膳食产品中包括PUFA如二十碳五烯酸[“ΕΡΑ”;ω-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”;co-3]的兴趣一直在持续地增长。有效地并高性价比地提取、精制和纯化包含PUFA的脂质组合物的方法因此是尤其期望的。
[0005]多种典型的脂质分离方法涉及破碎微生物细胞(例如经由机械、酶促或化学手段)，随后使用有机或绿色溶剂进行油提取。破碎方法从微生物细胞中释放细胞内脂质，这使得其在提取期间容易触及溶剂。在提取后，通常除去溶剂(例如通过蒸发如施加真空、温度或压力变化等除去)。
[0006]所得的提取油富含亲脂组分，其在脂质体中积累。一般来讲，脂质体的主要组分由TAG、麦角固醇酯、其它甾醇酯、游离麦角固醇和磷脂组成。存在于脂质体中的PUFA主要是TAG、二酰基甘油、单酰基甘油、磷脂和游离脂肪酸组分。可随后精制提取油以产生高度纯化的富含PUFA的TAG级份。关于纯化的TAG级份的最终规格可为用途依赖性的，例如，根椐油是否用作化妆品或药物组合物等中的添加剂或补充剂(例如在食物组合物、婴儿代乳品、动物饲料等中)。可接受的污染物标准是自己制定的(其中特定污染物导致不可取的特性，例如模糊/浑池、气味)或由外部营养委员会确定的(例如Voluntary Monograph Of TheCouncil for Responsible Nutrition [Washington, D.C.], 2006 年 3 月，指定了 ω-3ΕΡΑ、co-3DHA、以及它们的混合物的酸、过氧化物、茴香胺、Τ0Τ0Χ、多氯代二苯并-对-二氧杂环己烯和多氯代二苯并呋喃的最大值)。
[0007]美国专利6，727，373公开了包含PUFA的微生物油，其具有高甘油三酯含量和高氧化稳定性。此外，描述了一种从来源于经巴氏消毒的发酵液的微生物生物质中回收此类油的方法，其中所述微生物生物质经挤出形成颗粒、干燥、然后使用合适溶剂从干燥颗粒中提取所述油。
[0008]美国专利6，258，964公开了提取微生物细胞中包含的脂溶性组分的方法，其中该方法需要干燥包含脂溶性组分的微生物细胞，同时使用挤出机将干燥的微生物细胞破碎并模塑成粒料，并且使用有机溶剂提取包含的脂溶性组分。
[0009]美国专利申请公布2009/0227678公开了从包含细胞和水的组合物中获取脂质的方法，该方法包括使组合物与干燥剂接触并且从细胞中回收脂质。
[0010]美国专利4，675，132公开了浓缩鱼油中的PUFA部分的方法，所述鱼油包含相对低比例的饱和和单不饱和脂肪酸部分，其链长与拟浓缩的PUFA部分相同，包含具有低级链烷醇的酯交换鱼油甘油酯以形成低级烷基脂肪酸酯的混合物，并在超临界条件下用二氧化碳(CO2)提取所述酯。
[0011]开发用于产生高浓度EPA的连续逆流超临界CO2分级方法的工艺流程图由V.J.Krukonis 等人(Adv.Seafood Biochem.，Pap.Am.Chem.Soc.Annu.Meet.(1992)，召开年份:1987,169-179)公开。该方法的原料是鲱油的尿素结晶乙酯，并且该设计的基础是在90%的产量下产物浓度为90% EPA (乙酯)。
[0012]寻找其中可在包含PUFA的脂质组合物中调节TAG、二酰基甘油、单酰基甘油和游离脂肪酸的分配的方法。期望获得包含PUFA的脂质组合物的方法，所述组合物具有改善的氧化稳定性。也期望获得富含TAG的包含PUFA的脂质组合物的方法，该方法是用于获得此类组合物的经济型方法。
[0013]美国专利6，166，230 (GIST-Brocades)描述了用极性溶剂处理包含PUFA的微生物油(例如来自高山被孢霉(Mortierella alpina)的微生物油)以提取至少一种溶解在溶剂中的甾醇(例如链甾醇)，并且随后从油中分离至少一些包含该甾醇的溶剂的方法，其中油具有小于1.5%的甾醇含量。
[0014]美国专利7，695, 626 (Martek)描述了从微生物生物质(例如裂殖壶菌属(Schizochytrium))中回收包含PUFA的中性脂质的方法,所述方法包括下列步骤:在提取过程中使生物质与非极性溶剂接触以回收脂质，精制和/或漂白和/或除臭脂质组合物，将极性溶剂加到脂质组合物中，冷却混合物以选择性地沉淀至少一种其它化合物(例如饱和甘油三酯、含磷材料、蜡酯、包含留醇酯的饱和脂肪酸、留醇、角鲨烯、烃类)并且随后除去来自脂质组合物的这种不可取化合物。
[0015]以前的方法尚未利用短程蒸馏技术作为有效手段以避免将PUFA(具体地，高度不饱和的脂肪酸)暴露于高温并除去来自微生物油的麦角固醇(麦角-5，7，22-三烯-3 β -醇；CAS登录号57-87-4)污染物。
[0016]国际专利申请公布W02011/080503A2公开了用于从进料混合物中回收PUFA产物的色谱分离方法，该方法包括将进料混合物导入模拟的或实际的移动床色谱分离设备，该设备具有多个连接的色谱柱，它们包含作为洗脱液的醇水溶液，其中所述设备具有包括至少第一区域和第二区域的多个区域，每个区域具有提取物流和提余液流，从中可从所述多个连接色谱柱中收集液体，并且其中(a)包含PUFA产物连同极性较高组分的提余液流从第一区域内的柱中收集并被引入第二区域中的非邻近柱，和/或(b)包含PUFA产物连同极性较低组分的提取物流从第二区域内的柱中收集并被引入第一区域中的非邻近柱，所述PUFA产物与每个区域中的进料混合物的不同组分分离。纯化多种来源于鱼油的原料以制备85至大于98%的EPA乙酯。虽然国际专利申请公布W02001/080503A2展示了从鱼油中回收高纯度EPA和DHA的方法，该公开也声明适用于分馏的进料混合物可获取自“合成来源，包括获取自经基因修饰的植物、动物和微生物(包括酵母)的油”。此外，“当期望的PUFA产物是EPA时，经基因修饰的酵母尤其适用”。

【发明内容】

[0017]在第一实施例中，本发明涉及方法，其包括:
[0018](a)粒化具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质；
[0019](b)提取步骤(a)的粒状微生物生物质以产生提取油；以及
[0020](c)在短程蒸馏条件下蒸馏步骤(b)的提取油至少一次，其中所述蒸馏产生馏出液级份和含脂质级份。
[0021]在所述方法的第二实施例中，含油微生物选自酵母、藻类、真菌、细菌、类眼虫、原生藻菌和卵菌。优选地，酵母是耶氏酵母(Yarrowia)。
[0022]在所述方法的第三实施例中，含油微生物包含至少一种在油中的多不饱和脂肪酸，其中多不饱和脂肪酸优选选自:亚油酸、Y-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-Y-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6 二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、ω-3 二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
[0023]在所述方法的第四实施例中，微生物生物质的水分含量在约I至10重量％的范围内。
[0024]在所述方法的第五实施例中，所述步骤(a)粒化微生物生物质包括:
[0025](I)将微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物，所述破碎的生物质混合物包含破碎的微生物生物质；
[0026](2)将破碎的生物质混合物与至少一种粘合剂共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及
[0027](3)使所述可固化混合物形成固体粒料以提供粒状微生物生物质。
[0028]优选地，步骤(I)混合微生物生物质和(2)共混至少一种粘合剂在挤出机中进行，同时进行，或在挤出机中同时进行；并且步骤(3)由所述可固化混合物形成所述固体粒料包括选自下列的步骤:
[0029](i)通过模具挤出所述可固化混合物以形成股线；
[0030](ii)使所述股线干燥并破裂；以及
[0031](iii)将步骤⑴通过模具挤出所述可固化混合物以形成股线和步骤(ii)使所述股线干燥并破裂组合。
[0032]在本发明方法的第六实施例中，破碎的微生物生物质在双螺杆挤出机中产生，所述双螺杆挤出机包括:(a)约0.04至0.4KW/(kg/hr)的总比能量输入；(b)使用具有逐渐缩短的节线长度的轴衬元件的压实区；和(c)使用流量限制的压缩区；其中在挤出机内，压实区在压缩区之前。
[0033]在所述方法的第七实施例中，至少一种研磨剂优选具有选自下列的特性:
[0034](a)所述至少一种研磨剂为具有2.0至6.0的莫氏硬度和根据ASTM方法D1483-60测定的0.8或更高的吸油系数的颗粒；
[0035](b)所述至少一种研磨剂选自二氧化硅和硅酸盐；并且
[0036](c)所述至少一种研磨剂以固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约I至20重量％存在。
[0037]至少一种粘合剂优选具有选自下列的特性:
[0038](a)所述至少一种粘合剂选自水和碳水化合物，所述碳水化合物选自蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖和可溶性淀粉；并且
[0039](b)所述至少一种粘合剂以固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约0.5至10重量％存在。
[0040]在所述方法的第八实施例中，粒料具有选自下列的特性:
[0041](a)所述粒料具有约0.5至约1.5mm的平均直径和约2.0至约8.0mm的平均长度；并且
[0042](b)所述粒料包含以固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约70至约98.5重量％的包含含油微生物的微生物生物质，约I至约20重量％的至少一种能够吸收油的研磨剂和约0.5至10重量％的至少一种粘合剂。
[0043]在所述方法的第九实施例中，用有机溶剂进行提取以产生提取油，并且所述提取油在所述步骤(C)蒸馏提取油之前被脱胶和任选地漂白。
[0044]在所述方法的第十实施例中，提取包括:
[0045](I)用溶剂处理粒状微生物生物质，所述溶剂包括液体或超临界流体二氧化碳的，其中所述包含含油微生物的粒状微生物生物质还包含至少一种在油中的多不饱和脂肪酸，从而获取:
[0046]⑴包含基本上不含磷脂的脂质级份的提取物；和
[0047](ii)包含磷脂的残余生物质；以及
[0048](2)分馏步骤(I)部分(i)中获取的提取物至少一次以获取具有精制的脂质组合物的提取油，所述脂质组合物包含至少一种多不饱和脂肪酸，其中精制的脂质组合物相对于未用溶剂处理的粒状微生物生物质的油组合物富含三酰基甘油。
[0049]在所述方法的第十一实施例中，步骤(b)的提取油包含留醇级份，步骤(C)的馏出液级份包含留醇，并且步骤(C)的含脂质级份在与尚未经受短程蒸馏的提取油中留醇量进行比较时包含减少的留醇量。留醇级份可包含一种或多种留醇，所述留醇选自:豆留醇、麦角固醇、芸苔甾醇、菜油甾醇、β_谷甾醇和链甾醇。
[0050]在所述方法的第十二实施例中，具有精制的脂质组合物的提取油还包含至少300mg/100g的留醇级份，所述脂质组合物包含至少一种多不饱和脂肪酸并且相对于未用溶剂处理的粒状微生物生物质的油组合物富含三酰基甘油。在短程蒸馏条件下蒸馏至少一次时，产生包含留醇的馏出液级份和含脂质级份，所述含脂质级份包含三酰基甘油并且在与尚未经受短程蒸馏的具有精制的脂质组合物的提取油中留醇量进行比较时包含减少的甾醇量。
[0051 ] 在第十三实施例中，所述方法还包括:
[0052](d)对步骤(C)的含脂质级份进行酯交换；以及
[0053](e)对步骤(d)的经酯交换的含脂质级份进行富集以获取油浓缩物。[0054]在第十四实施例中，含油微生物积累微生物油超过其干细胞重量25% ;并且微生物油包含按总脂肪酸的重量％计30至70重量％的二十碳五烯酸且基本上不含二十二碳六烯酸；并且步骤(e)的富集通过至少两种方法的组合进行，所述第一方法包括分馏并且所述第二方法选自:尿素加合物形成、液相色谱、超临界流体色谱、模拟移动床色谱、实际移动床色谱、以及它们的组合；并且油浓缩物是包含按油的重量％计至少70重量％的二十碳五烯酸且基本上不含二十二碳六烯酸的二十碳五烯酸浓缩物。
[0055]牛物保藏
[0056]下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA20110-2209),并具有下列
名称、保藏号和保藏日期。
[0057]
【权利要求】
1.方法，包括: (a)粒化具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质； (b)提取步骤(a)的粒状微生物生物质以产生提取油；以及 (C)在短程蒸馏条件下蒸馏步骤(b)的提取油至少一次，其中所述蒸馏产生馏出液级份和含脂质级份。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述含油微生物选自酵母、藻类、真菌、细菌、类眼虫、原生藻菌和卵菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述含油微生物包含至少一种在所述油中的多不饱和脂肪酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物生物质的水分含量在约I至10重量％的范围内。
5.根据权利要求1所述的方法，步骤(a)中粒化所述微生物生物质包括: (1)将所述微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物，所述破碎的生物质混合物包含破碎的微生物生物质； (2)将所述破碎的生物质混合物与至少一种粘合剂共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及 (3)使所述可固化混合物形成固体粒料以提供粒状微生物生物质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述破碎的微生物生物质在双螺杆挤 出机中产生，所述双螺杆挤出机包括: (a)约0.04至0.4KW/(kg/hr)的总比能量输入(SEI)； (b)使用具有逐渐缩短的节线长度的轴衬元件的压实区；和 (c)使用流量限制的压缩区； 其中在所述挤出机内，所述压实区在所述压缩区之前。
7.根据权利要求5所述的方法，其中: (a)所述至少一种研磨剂具有选自下列的特性: (i)所述至少一种研磨剂为具有2.0至6.0的莫氏硬度和根据ASTM方法D1483-60测定的0.8或更高的吸油系数的颗粒； (?)所述至少一种研磨剂选自二氧化硅和硅酸盐；并且 (iii)所述至少一种研磨剂以所述固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约I至20重量％存在；和/或 (b)所述至少一种粘合剂具有选自下列的特性: (iv)所述至少一种粘合剂选自水和碳水化合物，所述碳水化合物选自蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖和可溶性淀粉；并且 (v)所述至少一种粘合剂以所述固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约0.5至10重量％存在。
8.根据权利要求5所述的方法，其中: (a)步骤(1)混合所述微生物生物质和(2)共混至少一种粘合剂在挤出机中进行，同时进行，或在挤出机中同时进行；并且 (b)步骤(3)由所述可固化混合物形成所述固体粒料包括选自下列的步骤:(i)通过模具挤出所述可固化混合物以形成股线； (ii)使所述股线干燥并破裂；以及 (iii)将步骤(i)通过模具挤出所述可固化混合物以形成股线和步骤(ii)使所述股线干燥并破裂组合。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述固体粒料具有选自下列的特性: (a)所述固体粒料具有约0.5至约1.5mm的平均直径和约2.0至约8.0mm的平均长度； (b)所述固体粒料具有约0.1至5.0重量％的水分含量；并且 (c)所述固体粒料包含以所述固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约70至约98.5重量％的包含含油微生物的微生物生物质，约I至约20重量％的至少一种能够吸收油的研磨剂和约0.5至10重量％的至少一种粘合剂。
10.根据权利要求1所述的方法，步骤(b)中用有机溶剂进行所述提取以产生提取油，并且所述提取油在所述步骤(C)蒸馏所述提取油之前被脱胶和任选地漂白。
11.根据权利要求1所述的方法，步骤(b)中所述提取包括: (I)用溶剂处理所述粒状微生物生物质，所述溶剂包括液体或超临界流体二氧化碳，其中所述包含含油微生物的粒状微生物生物质还包含至少一种在所述油中的多不饱和脂肪酸，从而获取: (1)包含基本上不含磷脂的脂质级份的提取物；和 (ii)包含磷脂的残余生物质；以及 (2)分馏步骤(1)部分(i)中获取的提取物至少一次以获取具有精制的脂质组合物的提取油，所述脂质组合物包含至少一种多不饱和脂肪酸，其中所述精制的脂质组合物相对于未用溶剂处理的粒状微生物生物质的油组合物富含三酰基甘油。
12.根据权利要求1所述的方法，其中: (i)步骤(b)的所述提取油包含留醇级份； (ii)步骤(c)的所述馏出液级份包含所述留醇；并且 (iii)步骤(c)的所述含脂质级份在与尚未经受短程蒸馏的提取油中留醇量进行比较时包含减少的甾醇量。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述留醇级份包含一种或多种留醇，所述甾醇选自:豆甾醇、麦角固醇、芸苔甾醇、菜油甾醇、β_谷甾醇和链甾醇。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述具有精制的脂质组合物的提取油还包含至少300mg/100g的留醇级份，所述脂质组合物包含至少一种多不饱和脂肪酸并且相对于未用溶剂处理的粒状微生物生物质的油组合物富含三酰基甘油。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在短程蒸馏条件下蒸馏所述具有精制的脂质组合物的提取油至少一次，其中所述蒸馏产生包含所述留醇的馏出液级份和含脂质级份，所述含脂质级份包含三酰基甘油并且在与尚未经受短程蒸馏的具有精制的脂质组合物的提取油中留醇量进行比较时包含减少的留醇量。
16.根据权利要求2所述的方法，其中所述酵母是耶氏酵母(Yairowia)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述耶氏酵母经重组工程化以产生多不饱和脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸选自:亚油酸、Y-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-Y-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6 二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、ω-3 二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
18.根据权利要求1所述的方法，还包括: (d)对步骤(C)的含脂质级份进行酯交换；以及 (e)对步骤(d)的经酯交换的含脂质级份进行富集以获取油浓缩物。
19.根据权利要求18所述的方法: (i)其中所述含油微生物积累微生物油超过其干细胞重量25%;并且 (ii)其中所述微生物油包含按总脂肪酸的重量％计30至70重量％的二十碳五烯酸且基本上不含二十二碳六烯酸；并且 (iii)其中步骤(e)的富集通过至少两种方法的组合进行，所述第一方法包括分馏并且所述第二方法选自:尿素加合物形成、液相色谱、超临界流体色谱、模拟移动床色谱、实际移动床色谱、以及它们的组合；并且 (iv)其中所述油浓缩物是包含按油的重量％计至少70重量％的二十碳五烯酸且基本上不含二十二碳六烯酸的二十碳五烯酸浓缩物。
20.根据权利要求11所述的方法，其中进一步提取所述包含磷脂的残余生物质以分离所述磷脂。
【文档编号】A01N37/00GK103841825SQ201280007938
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年2月10日 优先权日:2011年2月11日
【发明者】M.阿维高斯蒂, T.A.贝尔, R.E.博克拉斯, O.W.古特斯彻, K.W.胡特臣森, S-C.梁, R.D.奥尔兰迪 申请人:纳幕尔杜邦公司