保存细胞和细胞培养物的方法
【专利摘要】本发明提供了减少有核细胞中细胞凋亡的方法。本方法包括将有核细胞保持在容器中并向该容器中充入含有氙气的气体，以至该容器中的压力达到高于环境气压0.5-4.0个大气压；将该容器在高于环境气压0.5-4.0个大气压下保持一段时间，该期间容器内温度为22℃-37℃；压力维持在高于环境气压0.5-4.0个大气压的同时将容器内温度降至0.1℃–10℃并将容器保持一段时间；以及将容器中的压力降至环境压力并升温至22℃-37℃。通过实施这些步骤，该细胞发生的凋亡要低于参照。
【专利说明】保存细胞和细胞培养物的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本发明要求了 2011年2月7日提交的美国申请号为61/436，441的优先权，其公开内容通过引用纳入本文。
【技术领域】
[0003]本发明一般涉及细胞保存，更具体地涉及真核、有核细胞的体外保存。
【背景技术】
[0004]短期或长期内保存包括活细胞的生物材料是现代医疗科学中最大的挑战。在低温保护物质的存在下将温度降至_20°C至_176°C的范围依然是应用最广的活细胞保存方法。低温保护的机制涉及防止形成破坏细胞和/或细胞组分的冰晶。然而，这些方法和其它传统的保存细胞方法诱导了储存细胞的应激，而经过储存中所涉及处理的细胞有一部分几乎总会被诱导凋亡。(参见例如，de Boer F 等，J Hematother Stem Cell Res.2002Dec; 11 (6):951-63;Shapiro AM 等，Diabetes Technol Ther.2000Autumn;2(3):449-52;Cookson P等，Transfus Med.2010Dec; 20?): 392-402)。另外，直接获自器官和组织以及不经培养的细胞通常会在储存和运输中受到损伤。因此，存在正待满足和未满足的需求来改进保存细胞及保护它们免受储存和/或运输中致死事件(例如凋亡)的方法。本发明满足了这些和其他需求。
【发明内容】
[0005]本发明提供了减少细胞凋亡的方法。该方法包括以下一般步骤:i)将有核细胞保持在容器中并向该容器中充入含有氙气的气体，以至该容器中的压力达到高于环境气压
0.5-4.0个大气压；ii)将i) 中的容器在高于环境气压0.5-4.0个大气压下保持一段时间，该期间容器内温度为22°C -37°C ；iii)压力维持在高于环境气压0.5-4.0个大气压的同时将容器内温度降至0.1°C -1O0C ；iv)容器在0.10C - 10°C和高于环境气压0.5-4.0个大气压下保持一段时间；以及V)随后将容器中的压力降至环境压力并升温至22°C-37°C。按照该步骤处理的细胞中发生的凋亡要低于参照。
[0006]在各个实施方式中，容器保持在22°C _37°C和高于环境气压0.5-4.0个大气压下的时间为15分钟至24小时。容器保持在0.1°C - 10°C和高于环境气压0.5-4.0个大气压下的时间为2小时至3周，包括但不限于2小时至24小时,或至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天等,最高至3周。该方法减少哺乳动物细胞中的细胞凋亡，该哺乳动物细胞可以是人细胞。
[0007]该方法还提供冷冻组合物，该组合物包括有核细胞，其中，该细胞存于容器中，并保持在0.rc-1o°c的温度下，其中由于向该容器导入了含有氙气的气体，该容器中的压力高于环境气压0.5-4.0个大气压。
[0008]附图简要说明[0009]图1显示了基于根据流式细胞仪在所示温度下4个大气压下储存了 24小时后(图1A)和7天后(图1B)测定的人真核单核细胞淋巴瘤细胞系U-937细胞的百分数。细胞在容器中的皮氏培养皿，或在为细胞培养所设计的标准37°C CO2培养箱中(“对照”)的皮氏培养皿中储存所示时间。从储存中移出后，细胞在60分钟的时间内逐渐减压，用抗CD14抗体染色并通过流式细胞仪分选。抗CD14抗体是单核细胞和巨噬细胞的标记物。对抗CD14抗体染色呈阳性的总细胞百分数作图。
[0010]图2.显示在4个大气压的过量氙气的压力下储存24小时后活真核单核细胞淋巴瘤细胞系Jurkat细胞相对总细胞数的百分数。细胞如图1所述方法处理。细胞在细胞凋亡诱导物阿霉素(doxorubycine) (doxo)存在或不存在下,在所示温度下储存。用标准台盼蓝排除试验区分活细胞和死细胞。
[0011]图3.显示从储存条件转移放置在标准培养条件(37°C，空气中含5%C02)后培养物中活Jurkat细胞数的变化。细胞在标准条件下孵育前和孵育24小时后用台盼蓝染料染色以测定细胞数。对照组细胞生长在标准培养条件，环境压力下，包括储存时间。在实验第O天从相同烧瓶中取出对照细胞作为实验细胞并置于皮氏培养皿。图4显示通过向容器导入含有氙气的气体而得到的4个大气压的过度压力阻碍了 Jurkat细胞中自发性(图中的无阿霉素系列)和诱导性(图中的阿霉素系列)细胞凋亡的发展。在该组实验中监控储存3小时后的胱冬酶3活性。图5显示用能通过流式细胞仪对线粒体状态评估的染色试剂JC-1对真核单核细胞淋巴瘤细胞系U-937细胞(根据上述方法在超过环境压力4个大气压的氙气的压力下储存24小时(图5A)和7天(图5B)期间)染色。
[0012]图6.显示对根据本发明方法储存I天、14 天和28天的真核单核细胞淋巴瘤细胞系U-937细胞染色。用膜联蛋白-FITC/碘化丙锭染色试剂盒对该细胞染色，该试剂盒可区分活的、坏死的、早期和晚期凋亡的细胞。储存时间结束后，更换培养基，细胞在普通条件下再培养I天以评估回收率。“Xe+4”:气体混合物95%氙气+5%C02 (4个大气压的过度压力)在+4C下，“NG+4”:在环境压力下和+4C温度下储存；NG+37指37°C，5%C02下培养的参照样品，其中培养基每三天更换一次。
[0013]发明详述
[0014]本发明提供了抑制细胞凋亡的方法。该方法基于我们的以下发现:根据本文进一步描述来处理包含一定压力下的氙气和温度的气氛中所含有的有核细胞会减少该细胞中的细胞凋亡。本发明具体适用于在储存和/或运输期间减少细胞中的凋亡。在各个实施方式中，用本发明方法处理的细胞可在压力下0.1°C至+10°C的温度下储存最高至2周的时间。本发明可在不使用常规低温保护剂的情况下实施。
[0015]通常，本发明包括以下连续步骤:i)将有核细胞保持在容器中并向该容器中充入氙气或含有氙气的气体混合物，以至该容器中的压力达到高于环境气压0.5-4.0个大气压(1.5-5.0个大气压的绝对压力)；ii)将步骤i)的容器在高于环境气压0.5-4个大气压下保持一段时间，该期间容器内温度为22°C -37°C；iii)压力维持在高于环境气压0.5-4.0个大气压的同时将容器内温度降至0.10C -1O0C ；iv)容器在0.rc -10°C的温度下和高于环境气压0.5-4.0个大气压下保持一段时间；以及V)将步骤iv)容器中的压力降至环境压力并升温至22°C-37°C。通过实施这些步骤，步骤v)细胞中发生的凋亡低于参照。
[0016]根据本发明方法处理的细胞可用来比较的参照物可以是任何合适的参照物。例如，该参照物可以是没有接触过用于通过本发明方法处理细胞的一种或多种参数的对照细胞。参照物可以是标准曲线、曲线下面积、图表、表格或任何其它的数据呈现，可与这些数据比较本发明方法的作用。
[0017]在一个实施方式中，保持细胞的压力为高于环境气压0.5-4.0个大气压，所有压力精确至其间小数点后第一位。本文提及的所有压力是指超过一个大气压(高压的或高于大气压的)，除非另有说明。环境压力指不增加压力的正常大气压，通常在0.84-1.07个大气压的范围内，平均环境压力称为I个大气压。
[0018]本发明预期适于抑制任何有核细胞的凋亡。在各个实施方式中，用于本发明方法的细胞能够增殖。该细胞可具有沿着一种或多种谱系分化的潜能。因此该细胞可具有全能性、多潜能性、多能性或独能性(unipotentcy)。因此该细胞可以是干细胞、包括但不必限于成人干细胞、组织特异性干细胞、胎儿干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞或癌干细胞。在各个实施方式中，该细胞可衍生自多能细胞，例如间充质干细胞或造血干细胞。例如，成肌细胞和心肌细胞可衍生自间充质干细胞而造血干细胞可衍生自骨髓干细胞。在一个实施方式中，该细胞可以是单倍体，例如未受精的卵母细胞。
[0019]在某些实施方式中，该细胞可以是永生化的，例如一般通过分离自初始来源的增殖和/或传代细胞系建立。在其它实施方式中，该方法用于抑制细胞凋亡，该细胞分解自原始组织，例如从原始组织样品中获得的单个细胞悬液。在另一个实施方式中，根据本发明方法处理的细胞可以是组织的一部分，包括但不限于组织活检、组织切片或组织培养物。在一个实施方式中，用本发明方法处理的细胞不含血小板。在另一个实施方式中，用本发明方法处理的细胞不存在器官中。该细胞可从任何动物获得或衍生。在一个实施方式中，该动物是哺乳动物。在一个实施方式中，该哺乳动物是人。
[0020]如上所述，本发明方法涉及最初将有核细胞保持在容器中并向该容器中充入氙气(或含有氙气的气体混合物)，以至该容器中的压力达到高于环境气压0.5-4.0个大气压(包括端值)，包含其范围内所有精确到小数点后第一位的数值。其中，容器可以是适于容纳器皿的任何容器，细胞在该器皿中体外生长和/或储存。具体地，细胞可存于任何器皿例如试管、烧瓶、皮氏培养皿、Eppen dorf管、组织培养皿、多孔培养板等，该器皿可置于容器中。应认识到，当存有细胞的器皿置于容器中时，该器皿配制成其中的细胞暴露在容器中所充入的氙气里和压力下。例如，如果存有细胞的器皿是试管，该试管不密封以使充入容器的氙气对细胞产生压力并纳入该细胞。
[0021]充入氙气和容纳存有细胞的器皿的容器可以是任何合适的容器。合适的容器可以是刚性的，例如罐子、烧瓶、盒子或管子。该容器应该能维持气密环境。因此，该容器可以是能够密封的。该容器还可以是柔性的、可密封的容器，示例包括但不限于袋子。容器和充入的氙气(或含有氙气的气体混合物)优选无菌的。当实施本发明方法时，可用任何合适的系统调整容纳细胞的气氛以提供所需部分或所有氙气压力的气氛。该系统的一般特征包括气体储器，其中该储器优选操作性连接于该容器。合适的气体系统可包含部件，该部件包括但不限于阀、泵、扇、通气口及其组合，以及控制器，该控制器控制该系统部件并从而控制递送进该容器的气体量以及气体递送速率。该系统可另外包括一种或多种从该容器抽取含氙气的气氛和/或使该容器产生真空的部件。整个系统或任何部件或部件的部分可人工操作，或可自动化以至通过计算机和计算机程序操作。[0022]在一个实施方式中，该细胞储存或暴露在氙气CO2的气体混合物中并任选地含有氮气。因此，该气体混合物可以是9%氙气、5%C02和剩余的氮气至95%氙气和5%C02。在一个实施方式中，氙气(或含有氙气的气体混合物)导入容器的气氛中，伴随或不伴随去除存在的气体/空气，直到容器中空气气氛中的氙气浓度至少为9%。在一个实施方式中，容器中的气氛由氣气组成。在一个替换实施方式中，该气氛可有氣气和痕量杂质组成。因此在一个实施方式中，该气氛可基本由氣气和至少5%C02组成。
[0023]氙气最初充入该容器中的温度可变化，这取决于待处理的细胞类型。通常，该温度可以是22°C -37°C (包括端值)，并包含该范围间的任何整数以及连续整数间精确到小数点后第一位的所有数值。不考虑充入氙气或含氙气的气体混合物时的温度，一旦该容器中的压力达到高于环境气压0.5-4个大气压时，细胞在该压力下在容器中保持一段时间，该时间期间容器中的温度为22°C -37°C (包括端值)，包含其范围间精确到小数点后第一位的所有数值。细胞在该温度和压力范围下保持的时间可在15分钟-24小时之间变化，包括该范围间的所有时段。关于这一点，并且不受任何具体理论限制，认为细胞保持在22°C -37°C和高于环境气压0.5-4个大气压下会使细胞被氙气饱和，这点连同本方法剩余步骤的操作会使细胞中的凋亡得到抑制，从而改进细胞在储存和/或运输期间的耐久性。
[0024]细胞在高于环境气压0.5-4.0个大气压下22°C _37°C下保持15分钟-24小时后，容器中的温度降至ο.rc -1o°c(包括端值)，并包含其范围间的所有整数以及连续整数间精确到小数点后第一位的所有数值，同时压力维持在高于环境气压0.5-4.0个大气压下。在一个实施方式中，通过将该容器放在冷冻空间中来降低容器温度。该温度和压力范围维持一段时间，该时间可在2小时至3周之间变化，包括其范围间的所有整数，但不低于细胞在容器中到达0.rc至+10°C温度的所需时间。因此，本发明用于将细胞在低温和高压下储存
7、8、9、10、11、12、13、14 天或更多天。
[0025]细胞在高于环境气`压0.5-4.0个大气压和0.1°C至+10°C下保持后，容器中的压力下降至环境压力(例如通过阀或盖子释放)且容器中的温度升高至22°C -37°C之间(包括端值)，并包含其范围间的所有整数以及连续整数间精确到小数点后第一位的所有数值。这些细胞相比参照细胞凋亡发生较少。
[0026]含有根据本发明方法处理的细胞的容器可运输到位置和/或个体或实体以用于各种方法的应用，且该细胞相比参照细胞凋亡发生较少。
[0027]本发明还提供了冷冻组合物，该组合物包括有核细胞，所述细胞在压力下暴露在高浓度氙气或含氙气的气体混合物中，其相比没有在压力下暴露在高浓度氙气或含氙气的气体混合物中的细胞发生更少的凋亡。
[0028]以下实施例是为了说明而非限制本发明。
[0029]为得到这些实施例中所示的数据,真核单核细胞淋巴瘤细胞U-937在补充有15%胎牛血清和10mkg/ml庆大霉素的RPM1-1640培养基中在5%C02，37°C的气氛下生长。将含有指数生长期细胞培养物的皮氏培养皿放到支撑架上并转移到容器中，该容器内容积大约
1.5L，为高压条件的储存而设计。Xe-CO2 (分别为95%和5%)气体混合物用于5_10分钟内形成高于环境气压0.5-4.0个大气压的压力，具体参数参见本文附图所示。本发明该实施例中温度保持在22°C _37°C下。根据气体分压计算，将气体在单独的槽中混合(或在容器/管中)。具有皮氏培养皿的容器在该温度和压力下保持2小时。然后将该容器转移至降低温度(0.rc至+5°C)的冰箱，同时保持该压力。该容器在该条件下保持大约4周。之后，释放压力，保持该细胞的容器在日常环境中在+4°C至+10°C和环境压力下保存7天。
[0030]我们选择根据之前的步骤来处理Jurkat和U-937，因为它们有细胞核和完整的细胞凋亡级联机制。因此，这些细胞响应大量胞外和胞内促凋亡信号并用作模型细胞来分析细胞凋亡(Pimentel-Muifios FX, Seed B.Regulated commitment of TNF receptorsignaling:a molecular switch for death or activation (“调节的 TNF 受体信号传导定型:死亡和活化的分子开关”).1mmunity.1999年12月;11 (6): 783-93;KarasM, ZaksTZ, Liu JL,LeRoith D.T cell receptor-1nduced activation and apoptosis incycling human T cells occur throughout the cell cycle (“循环人 T 细胞中 T细胞受体诱导的活化和凋亡发生在整个细胞循环中Mol BioI Cell.1999年12月；10 (12): 4441-50;Valavanis C，Hu Y,Yang Y,Osborne BA,Chouaib S,GreeneL,Ashwell JD, Schwartz LM.Model cell lines for the study of apoptosis in vitro(“永固体外研究细胞凋亡的模型细胞系Methods Cell Biol.2001;66:417-36)。
[0031]细胞经过本发明方法处理后，我们分析了活细胞数(图1)，和指示细胞凋亡强度的胱冬酶-3活性(图2)。图1和图2所示的数据确定本发明方法抑制了自发性细胞死亡。
[0032]采用氙气的处理还改善了接触阿霉素后的细胞生长。具体地，参照(对照)细胞继续出现阿霉素诱导性死亡，却观察到经氙气处理(Xe+37doxo，Xe+4doxo)的样品中活细胞数增加了。氙气阻碍了 Jurkat (图4)和U-937细胞(图5)中自发性(无阿霉素，不经处理)和诱导性(阿霉素)细胞凋亡的发展。
[0033]阿霉素是一种已知的细胞凋亡诱导物，其对线粒体膜电位造成损伤。氙气(无论与和不与冷却联用)对细胞线粒体产生保护性作用。例如，储存24小时和7天后，在氙气的存在下，经阿霉素处理的细胞中线粒体未损伤的百分数都显著高于无氙气储存的细胞(图5)。储存7天后，氙气相对对照(无气体，37°C)还显著降低了线粒体的损伤，这是由于培养基中细胞生长没有细胞分裂一正常情况下这些细胞每2-3天分裂一次。相信对线粒体的保护是因为氙气的存在保护器官免受 冷冻的作用(图2，含和不含阿霉素的Xe+4组以及NG+4组)。
[0034]虽然出于说明目的详细描述了本发明，但应理解，这些详细描述只是为了说明，本领域技术人员在不背离所附权利要求书限定的本发明构思和范围的情况下，可以对其作出改动。
【权利要求】
1.一种减少细胞中细胞凋亡的方法，所述方法包括: i)将有核细胞保持在容器中并向所述容器充入含氙气的气体，以至所述容器中的压力达到高于环境气压0.5-4.0个大气压； ?)将i)所述的容器在所述压力下保持一段时间，所述时间内所述容器内的温度为22 0C -37 0C ； iii)维持所述压力的同时将所述容器的温度降低至0.10C -1O0C ； iv)将所述容器在iii)所述的温度和压力下保持一段时间；并且v)随后将iv)所述容器内的压力降至环境压力并将所述温度提高至22°C-37°C ； 其中V)所述容器中的细胞相对参照发生更少的细胞凋亡。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，ii)所述的一段时间为15分钟至24小时。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，iv)所述的一段时间为2小时至3周。
4.如权利要 求3所述的方法，其特征在于，iv)所述的一段时间至少为2天。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，iv)所述的一段时间至少为7天。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，iv)所述的一段时间至少为14天。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，iii)所述的压力为高于环境气压3-4个大气压。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，iv)所述的压力为高于环境气压3-4个大气压。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，iv)所述的温度为4°C-10°C。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是哺乳动物细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述细胞是人细胞。
12.—种包括有核细胞的冷冻组合物，其中所述细胞存在容器中并保持在0.10C -1O0C的温度下，其中由于向所述容器导入含有氙气的气体，所述容器中的压力为高于环境气压0.5-4.0个大气压。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述细胞是人细胞。
【文档编号】A01N1/02GK103442557SQ201280008033
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年2月3日 优先权日:2011年2月7日
【发明者】W·E·格里索伯, J·S·琼斯, S·科根, I·伊琳, N·I·英努卡什维利, Y·A·菲尔基纳, A·N·舒密夫, S·A·科尔查诺夫 申请人:先进保存技术股份有限公司