专利名称：荧光dna－寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法及应用的制作方法
荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法及应用技术领域
本发明属于DNA杂化水凝胶的研究技术领域，特别涉及一种荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法及其在杀菌调控方面的新用途。
背景技术：
凝胶态是一种近似于固态，其分子之间通过一些非共价作用力形成三维网络结构而把溶剂分子固定在其中形成的。
近年来，脱氧核糖核酸(DNA)水凝胶在药物释放、组织工程、成像、医疗设备、基因治疗、生物传感方面具有广泛的应用前景，水凝胶具有三维网络结构，在水中能够吸收大量的水分溶胀，并在溶胀后继续保持其原有结构而不被溶解。水凝胶类似于生命组织材料，在与血液、体液及人体组织相接触时，表现出良好的生物相容性。
对于很多能够与之发生共轭聚合的电解质有很多文献报道，如有人提出的水溶性共轭寡聚电解质，其中有的水溶性共轭寡聚电解质具有杀菌效果，并且水溶性好，与细菌的细胞膜有很好的亲和性，进而导致细胞膜凝聚、裂解甚至死亡。但是其制备方法复杂，而且用于杀菌时其杀菌过程都是不可控制的，因此有待设计可控的释放杀菌剂的体系。发明内容
本发明提供了一种合成方法简单且能将寡聚苯撑乙炔有效包裹的DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法。
本发明还提供了上述DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶在调控杀菌方面的新用途。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是该荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成由以下方法制备
将DNA溶于浓度为O. 01mol/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液中至完全溶解，加入乙二醇二缩水甘油醚和寡聚苯撑乙炔溶液，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:25 50 :15 30，在超纯水中渗析10 30小时，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶。
上述寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚的质量比优选为1:30 40 20 28。
上述DNA的分子量是IXlO6 IX 107。
上述羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液的pH为6. 8 8. 2。
上述的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶在调控杀菌方面的应用，其使用方法如下 在菌类悬浮液中加入DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶和脱氧核糖核酸酶，暗处孵化20分钟，白光照射30分钟。在Img DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶中添加10 100U的脱氧核糖核酸酶。
本发明合成了一种荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶，其采用DNA作水凝胶网状框架与寡聚苯撑乙炔通过静电作用合成一种新型的DNA杂化水凝胶，合成方法简单，条件温和， 该水凝胶能将寡聚苯撑乙炔有效包裹在DNA的网状结构中，阻碍其与细菌接触；该水凝胶可 应用于调控杀菌方面，当其中加入脱氧核糖核酸酶时，DNA的网状结构被破坏，释放出寡聚苯撑乙炔，游离的寡聚苯撑乙炔可接近细菌或进入细菌中，在白光照射下产生单线态氧或活性氧物质，进而杀死细菌，利用脱氧核糖核酸酶，实现杀菌的可控性。
图1为未添加DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的空白培养板细菌分布照片。图2为添加了 DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的培养板细菌分布照片。图3为添加了 DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶和脱氧核糖核酸酶的培养板细菌分布照片。图4为实施例1合成的DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的表面形貌扫描电镜照片。图5为DNA的荧光显微镜相差图片。图6为实施例1合成DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的荧光显微镜相差图片图7为实施例1合成DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的荧光图片。图8为实施例1合成DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶水解的琼脂糖凝胶电泳照片。
具体实施例方式现结合实施例和附图对本发明的技术方案进行进一步说明，但是本发明不仅限于下述的实施方式。 实施例1取原料寡聚苯撑乙炔Ig为例，合成荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的方法是将35g分子量为I X IO6 IXlO7的DNA (Sigma公司)溶于浓度为O. 01mol/L、pH为7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解,形成DNA的溶液，向其中加入25g乙二醇二缩水甘油醚(百灵威科技有限公司)，再将Ig寡聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑乙炔溶液与加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:35 :25，在超纯水中渗析20小时，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶。上述寡聚苯撑乙炔的制备方法，参考ACS物理化学快报“End-Only”中公开的文献“功能化寡聚苯乙炔的合成，光物理性质及杀菌活性的研究”(FunctionalizedOligo (phenylene ethynylene)s: Synthesis, Photophysical and Biocidal Activity,TheJournal of Physical Chemistry Letters,2010, I (21)，3207-3212.)。实施例2取原料寡聚苯撑乙炔Ig为例，合成荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的方法是将40g分子量为I X IO6 IXlO7的DNA (Sigma公司)溶于浓度为O. 01mol/L、pH为7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解,形成DNA的溶液，向其中加入28g乙二醇二缩水甘油醚(百灵威科技有限公司)，再将Ig寡聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑乙炔溶液与加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:40 :28，在超纯水中渗析20小时，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶。实施例3取原料寡聚苯撑乙炔Ig为例，合成荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的方法是将30g分子量为I X IO6 IXlO7的DNA (Sigma公司)溶于浓度为O. 01mol/L、pH为7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解,形成DNA的溶液，向其中加入20g乙二醇二缩水甘油醚(百灵威科技有限公司)，再将Ig寡聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑乙炔溶液与加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:30 :20，在超纯水中渗析20小时，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶。
实施例4
取原料寡聚苯撑乙炔Ig为例，合成荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的方法是将 25g分子量为I X IO6 IXlO7的DNA (Sigma公司)溶于浓度为O. 01mol/L、pH为7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解,形成DNA的溶液，向其中加入15g乙二醇二缩水甘油醚(百灵威科技有限公司)，再将Ig寡聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑乙炔溶液与加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:25 :15，在超纯水中渗析20小时，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶。
实施例5
取原料寡聚苯撑乙炔Ig为例，合成荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的方法是将 50g分子量为I X IO6 IXlO7的DNA (Sigma公司)溶于浓度为O. 01mol/L、pH为7的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解,形成DNA的溶液，向其中加入30g乙二醇二缩水甘油醚(百灵威科技有限公司)，再将Ig寡聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液，将寡聚苯撑乙炔溶液与加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:50 :30，在超纯水中渗析20小时，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水·凝胶。
实施例6
在上述实施例1 5的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法中将分子量为I X IO6 I X IO7的DNA (Sigma公司)溶于浓度为O. 01mol/L、pH为6. 8的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解，形成DNA的溶液，然后加入乙二醇二缩水甘油醚 (百灵威科技有限公司)，再将寡聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液， 将寡聚苯撑乙炔溶液加入上述DNA溶液中，在超纯水中渗析10小时，其它的步骤与相应实施例相同，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶。
实施例7
在上述实施例1 5的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法中将分子量为I X IO6 I X IO7的DNA (Sigma公司)溶于浓度为O. 01mol/L、pH为8. 2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解，形成DNA的溶液，然后加入乙二醇二缩水甘油醚 (百灵威科技有限公司)，再将寡聚苯撑乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撑乙炔溶液， 将寡聚苯撑乙炔溶液加入上述DNA溶液中，在超纯水中渗析30小时，其它的步骤与相应实施例相同，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶。
上述实施例1 7的方法所合成的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶(下述简称 DNA - 0ΡΕ)应用于调控杀菌体系中，现以大肠杆菌为例，其具体的使用方法如下
步骤1:挑取大肠杆菌的单克隆菌落置于5mL含50μ g/mL卡那霉素(Kana)的LB液体培养基中，37°C摇床振荡培养过夜(约12h)，得到活化的菌液，取活化菌液离心，0. 9%NaCl溶液洗细菌三次，0. 9%NaCl溶液悬浮细菌，稀释至0D600nm=l. 0。步骤2 :取三组100 μ L细菌悬浮液，第一组中加入400 μ L0. 9%NaCl溶液，室温暗处孵育20min，然后用白光照射样品30分钟(90mW/cm2)，作为空白实验；第二组中加入400 μ L0. 9%NaCl溶液和浓度为2. 5mg/mL的实施例1的DNA - OPE水凝胶溶液40 μ L，室温暗处孵育20min，然后用白光照射样品30分钟(90mW/cm2)，作为对比实验；第三组中加入400 μ L0. 9%NaCl溶液和浓度为2. 5mg/mL实施例1的DNA -OPE水凝胶溶液40 μ L与IOU的脱氧核糖核酸酶(DNase),室温暗处孵育20min,然后用白光照射样品30分钟(90mW/cm2)；步骤3 :将上述三组的菌液连续稀释6X 104倍，分别取100μL的大肠杆菌(E. coli)菌液涂布于固体LB培养板上，37°C孵育12 14h，琼脂糖固体培养基的直径为
90mm，计数培养板上形成的细菌克隆数，计算公式为
权利要求
1.一种荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法，其特征在于由以下方法制备 将DNA溶于浓度为O. Olmol/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液中至完全溶解，加入乙二醇二缩水甘油醚和寡聚苯撑乙炔溶液，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚的质量比为I 25 50 :15 30，在超纯水中渗析10 30小时，得到DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶。
2.根据权利要求1所述的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法，其特征在于将DNA溶于浓度为O. 01mol/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液中至完全溶解，加入乙二醇二缩水甘油醚和寡聚苯撑乙炔溶液，寡聚苯撑乙炔与DNA、乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:30 40:20 28。
3.根据权利要求1所述的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法，其特征在于所述DNA的分子量是I X IO6 I X IO7。
4.根据权利要求1所述的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶的合成方法，其特征在于所述羟乙基哌嗪乙硫磺酸溶液的pH为6. 8 8. 2。
5.权利要求1 4任一项所述的荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶在调控杀菌方面的应用，其使用方法如下在菌类悬浮液中加入DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶和脱氧核糖核酸酶，暗处孵化20分钟，白光照射30分钟。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于在ImgDNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶中添加10 100U的脱氧核糖核酸酶。
全文摘要
本发明合成了一种荧光DNA-寡聚苯撑乙炔水凝胶，其采用DNA作水凝胶网状框架与寡聚苯撑乙炔通过静电作用合成一种新型的DNA杂化水凝胶，合成方法简单，条件温和，该水凝胶能将寡聚苯撑乙炔有效包裹在DNA的网状结构中，阻碍其与细菌接触；该水凝胶可应用于调控杀菌方面，当其中加入脱氧核糖核酸酶时，DNA的网状结构被破坏，释放出寡聚苯撑乙炔，游离的寡聚苯撑乙炔可接近细菌或进入细菌中，在白光照射下产生单线态氧或活性氧物质，进而杀死细菌，利用脱氧核糖核酸酶，实现可控性的杀菌。
文档编号A01N25/26GK103053517SQ20131002029
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者唐艳丽, 曹阿丽, 刘越 申请人:陕西师范大学