专利名称：诱导渐渗系水稻RZ1和RZ2中的Homebox基因发生甲基化升高的方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导渐渗系水稻RZl和RZ2中的Homebox基因发生甲基化升高的方法。
背景技术：
在真核生物的DNA中，5-甲基胞嘧啶(5_mG)是唯一存在的化学性修饰碱基。DNA甲基化(DNA methylation)是由 DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMTs)催化 S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的一种反应。一定的DNA甲基化类型在减数分裂或有丝分裂之后能被子细胞遗传，这在生物表观遗传中有着极其重要的作用，被认为是表观遗传的主要形式。CG核苷酸是最主要的甲基化位点，在哺乳动物中5-甲基胞嘧啶约占胞嘧啶总量的2-7%。DNA的甲基化并不改变基因的碱基序列而是通过影响基因的表达而影响其功能，一般说来，DNA的甲基化会抑制基因的表达。研究表明，基因组印记、X染色体的失活和许多肿瘤相关基因的失活都与基因启动子区CG岛的甲基化有关。植物中，大约有20%_30%的核基因组DNA胞嘧啶处于甲基化状态，对称的CG和CA(T)G被证明甲基化频率最高，基因组内也有CCG中外侧胞嘧啶甲基化，但频率低于以上两种模式。大多数DNA甲基化发生于富含转座子的异染色质区，但对全基因组范围内甲基化图谱的研究表明，有20%-33%的重要基因区也发生甲基化。在植物中，DNA甲基化有助于转录沉默转座因子或外源DNA，维持非同源重组基因组的稳定和控制一些基因的转录，在转座子的活跃，防御外源DNA、甚至在特异基因表达模式上起关键作用。当基因处于表 达状态时，甲基化水平往往很低，但随着生长发育的进行需要将该基因关闭，则会在该基因的启动子或编码区发生重新甲基化，基因转录受到抑制，基因失活，最终导致表达的沉默。基因表达调控过程是一系列核酸-蛋白质相互作用的结果，转录过程中DNA-蛋白质的相互作用更是密不可分。基于以上事实，DNA甲基化调控基因表达的分子机理为:DNA的甲基化或去甲基化会改变DNA分子构象，从而导致某些重要基团的隐蔽或暴露，使其削弱或增强了 DNA与蛋白质因子(如阻抑蛋白、转录必需酶等)的结合，最终影响到某些基因的表达，使得有些基因表达受到抑制甚至丧失其功能，有些基因表达则被激活。限制性内切酶HpaII和限制性内切酶MspI是一对同裂酶，均可识别CCGG位点，但对甲基化的敏感程度不同。限制性内切酶HpaII对内外侧全甲基化敏感，对内外侧半甲基化不敏感，即可以酶切CCGG和内外侧半甲基化的CCGG，但不能酶切内外侧全甲基化的CCGG。限制性内切酶MspI对外侧全甲基化敏感，对外侧半甲基化敏感，即可以酶切未甲基化的CCGG，不能酶切外侧全甲基化的CCGG和外侧半甲基化的CCGG。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导渐渗系水稻RZl和RZ2中的Homebox基因发生甲基化升高的方法。本发明提供了一种诱导渐渗系水稻RZl中的Homebox基因发生甲基化水平升高的方法，是用含有重金属离子的溶液处理渐渗系水稻RZl。本发明还提供了一种诱导渐渗系水稻RZ2中的Homebox基因发生甲基化水平升高的方法，是用含有重金属离子的溶液处理渐渗系水稻RZ2。以上任一所述Homebox基因可为编码序列表的序列I所不的Homebox蛋白的基因。以上任一所述Homebox基因具体可为如下(I)或(2):(I)编码区如序列表的序列2自5’末端第110至661位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2所示的DNA分子。以上任一所述的方法中，所述重金属可为镉或铬。以上任一所述的方法中，所述含有重金属离子的溶液中重金属离子的浓度为0.05-1.0mmol /I,,具体可为 0.0SmmoI /I,或 1.0mmol /I,η以上任一所述的方法中，所述含有重金属离子的溶液具体可为含有重金属离子的水稻营养液。
金属离子的溶液具体可为在水稻营养液中加入CdCl2或CrCl3得到的溶液。所述水稻营养液的pH具体可为5.3，溶剂为水，含有如下溶质:1.44mM NH4NO3^0.32mM NaH2P04、0.6mM K2SO4U.0mM CaCl2U.6mM MgS04、0.072mM Fe_EDTA、0.2mM Na2SiO3'
9.1 μ M MnCl2、0.154 μ M ZnSO4,0.156 μ M CuSO4,18.5 μ M H3BO3 和 0.526 μ M Η2Μο04。以上任一所述的方法中，所述渐渗系水稻RZl为一叶一心期的渐渗系水稻RZ1。以上任一所述的方法中，所述渐渗系水稻RZ2为一叶一心期的渐渗系水稻RZ2。以上任一所述的方法中，所述处理的时间可为7天。所述处理的方法具体可为:在所述含有重金属离子的溶液中培养所述渐渗系水稻。所述处理过程中，每天更换新的所述含有重金属离子的溶液。所述甲基化水平升高具体可为CCGG位点外侧胞嘧啶半甲基化水平升高。本发明还保护以上任一所述方法在水稻育种中的应用。目前有关重金属污染对作物伤害的研究多集中于研究重金属胁迫下对作物的外在表型、内部结构、酶活性差异及氧化胁迫过程等生理、生化后果，对于重金属处理后水稻发生DNA甲基化变异的研究极少，而具体涉及到水稻渐渗系在重金属胁迫下所发生的DNA甲基化变异的研究还未见，本发明是世界首例。本发明侧重于单一重金属镉和铬对渐渗系水稻RZl和RZ2的DNA甲基化的影响，采用Southern杂交的方法对水稻渐渗系在上述重金属胁迫下Homebox基因的甲基化情况进行分析。对于在重金属污染环境中的植物抗性和基因组进化等关系的研究作出了基础性工作。
图1为Homebox基因的Southern杂交图谱.
图 2 为 Elongation factor 基因 Southern 杂交图谱.
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。提及渐渗系水稻RZ1(introgressionline RZl)、渐渗系水稻RZ2(introgressionline RZ2)和渐渗系水稻 RZ35 (introgression line RZ35)的文献如下:Extent andpattern of DNA methylation alteration in rice lines derived from introgressivehybridization of rice and Zizania latifolia Griseb.Dong et al.Theor ApplGenet (2006) 113:196 - 205。渐渗系水稻RZl、渐渗系水稻RZ2和渐渗系水稻RZ35是通过“复态授粉法”得到的，具体过程如下:在松前开花期，早晨四点将其去雄后用育种袋将花序包好；第二天早上用菰的花粉给去雄后的松前授粉；40-50个小时后，用松前的花粉进行第二次授粉；通过这种方法得到一株具有菰的特征的Fl代杂种植株，细胞学观察，该植株的染色体数目与母本水稻完全相同；该？1代杂种保持严格自交，最后得到能够稳定遗传的渐渗系。实施例1、通过重金属离子处理促进渐渗系水稻RZl和渐渗系水稻RZ2中Homebox基因的甲基化升闻一、重金属离子处理分别将渐渗系水稻RZ1、渐渗系水稻RZ2和渐渗系水稻RZ35的种子进行如下处理:1、选择饱满、色泽好的水稻种子，用蒸馏水清洗后放入铺有消毒纱布的培养皿，28°C黑暗培养2天(培养过程中用蒸馏水保持纱布湿润)，种子发芽。2、将装有发芽的种子的培养皿转移到26°C光照培养箱中(每天光照12小时、黑暗12小时；培养过程中用蒸馏水保持纱布湿润)，当幼苗叶长到培养皿盖的时候将培养皿盖打开，直至幼苗长至一叶一心时(大约培养I周后达到一叶一心)。3、分组处理:第一组(Cd-L):将步骤2得到的幼苗在含有0.05mmol/L CdCl2的水稻营养液中培养7天,每天更换新鲜的含有0.05mmol/L CdCl2的水稻营养液；第二组(Cd-H):将步骤2得到的幼苗在含有1.0mmoI/L CdCl2的水稻营养液中培养7天,每天更换新鲜的含有1.0mmol/L CdCl2的水稻营养液；第三组(Cr-L):将步骤2得到的幼苗在含有0.05mmol/L CrCl3的水稻营养液中培养7天,每天更换新鲜的含有0.05mmol/L CrCl3的水稻营养液；第四组(Cr-H):将步骤2得到的幼苗在含有1.0mmol/L CrCl3的水稻营养液中培养7天,每天更换新鲜的含有1.0mmol/L CrCl3的水稻营养液；第五组(Mock):将步骤2得到的幼苗在水稻营养液中培养7天，每天更换新鲜的水稻营养液；培养条件 为:26°C，每天光照12小时、黑暗12小时。水稻营养液(pH5.3):溶剂为水，含有如下溶质:1.44mM NH4N03、0.32mM NaH2PO4,0.6mM K2SO4U.0mM CaCl2U.6mM MgSO4、0.072mM Fe_EDTA、0.2mM Na2SiO3,9.ΙμΜ MnCl2,0.154 μ M ZnSO4,0.156 μ M CuSO4,18.5 μ M H3BO3 和 0.526 μ M H2MoO4。4、完成步骤3后，收集植株叶片并提取基因组DNA。5、以步骤4提取的基因组DNA为模板，用限制性内切酶HpaII (用H表示)或限制性内切酶MspI (用M表示)进行酶切。6、将步骤5的酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(电压为17V，36h)，然后将凝胶在
0.25mol/L HCl水溶液中处理15分钟(使DNA脱嘌呤)，用蒸馏水洗涤凝胶，然后将凝胶上的DNA 转移到 Hybond N+ 尼龙膜(Amersham)上。7、将步 骤5得到的Hybond N+尼龙膜进行Southern杂交。Southern杂交中用于检测Homebox基因(AB007627)的探针如序列表的序列2自5’末端第243-1050位核苷酸所示(Homebox基因如序列表的序列2所示，编码序列表的序列I所示的Homebox蛋白，其开放阅读框为自5’末端第110至661位核苷酸)。Southern杂交中用于检测Elongation factor基因(D12821)的探针如序列表的序列4自5’末端第113-907位核苷酸所示(Elongation factor基因如序列表的序列4所示,编码序列表的序列3所示的Elongation factor蛋白，其开放阅读框为自5’末端第55至726位核苷酸)。探针的标记米用 Amersham Pharmacia 公司生产的 Gene Images Alkphos Direct LabellingSystem试剂盒进行。Homebox基因的Southern杂交图谱见图1,A为渐渗系水稻RZ35，B为渐渗系水稻RZ1，C为渐渗系水稻RZ2，箭头示甲基化的降低，*号示甲基化的升高，点样孔均位于凝胶顶部。对于渐渗系水稻RZ35来说:H酶切后，各组的图谱没有明显变化；M酶切以后，Mock组自上向下(也就是分子量自大至小)显示4条带，依次命名为条带-1、条带-11、条带-1II和条带-1V ;Cd-L组M酶切以后，条带-1变浅，表示该组处理诱导了 Homebox基因的甲基化水平降低，从而使得大分子量片段被酶切成小分子量片段；Cd-H组M酶切以后，条带-1基本消失，条带-1II和条带-1V变深，表示该组处理诱导了Homebox基因的甲基化水平降低，从而未使得大分子量片段被酶切成小分子量片段；Cr-L组M酶切以后，条带-1基本消失，表示该组处理诱导了 Homebox基因的甲基化水平降低，从而使得大分子量片段被酶切的小分子量片段；Cr-H组M酶切以后，条带-1基本消失，条带-1I变浅、条带-1II和条带-1V变深，表示该组处理诱导了 Homebox基因的甲基化水平降低，从而使得大分子量片段被酶切成小分子量片段。对于渐渗系水稻RZl来说:H酶切后，各组的图谱没有变化；M酶切以后，Mock组显示I条带，将其命名为条带-V ;Cd_L组M酶切以后，条带-V变浅，出现了一条分子量大于条带-V的新条带，表示该组处理诱导了 Homebox基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段，小分子量片段减少；Cd-H组M酶切以后，出现了一条分子量大于条带-V的新条带，表示该组处理诱导了 Homebox基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段；Cr-L组M酶切以后，出现了一条分子量大于条带-V的新条带，表示该组处理诱导了 Homebox基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段；Cr-H组M酶切以后，出现了一条分子量大于条带-V的新条带，表示该组处理诱导了Homebox基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段。对于渐渗系水稻RZ2来说:H酶切后，各组的图谱没有变化；M酶切以后，Mock组显示I条带，将其命名为条带-VI ;Cd_L组M酶切以后，出现了分子量大于条带-VI的新条带，表示该组处理诱导了 Homebox基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段；Cd-H组M酶切以后，出现了分子量大于条带-VI的新条带，表示该组处理诱导了 Homebox基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段；Cr-L组M酶切以后，出现了分子量大于条带-VI的新条带，表示该组处理诱导了 Homebox基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段；Cr-H组M酶切以后，出现了分子量大于条带-VI的新条带，表示该组处理诱导了 Homebox基因的甲基化水平升高，从而出现了大分子量片段。从图1A可以观察到，镉离子和铬离子处理后，渐渗系水稻RZ35的Homebox基因出现了 CCGG位点外侧胞嘧啶半甲基化水平降低，渐渗系水稻RZl和渐渗系水稻RZ2的Homebox基因出现了 CCGG位点外侧胞嘧啶半甲基化水平升高。Elongation factor基因Southern杂交图谱见图2, A为渐渗系水稻RZ35,B为渐渗系水稻RZl, C为渐渗系水稻RZ2。对于渐渗系水稻RZ35、渐渗系水稻RZl和渐渗系水稻RZ2来说，各组H酶切后的图谱或M酶切后的图谱没有明显变化。镉离子和铬离子处理后，渐渗系水稻RZ35、渐渗系水稻RZl和渐渗系水稻RZ2的Elongation factor基因的甲基化水平均无明显变化。`
权利要求
1.一种诱导渐渗系水稻RZl中的Homebox基因发生甲基化水平升高的方法，是用含有重金属离子的溶液处理渐渗系水稻RZl。
2.一种诱导渐渗系水稻RZ2中的Homebox基因发生甲基化水平升高的方法，是用含有重金属离子的溶液处理渐渗系水稻RZ2。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述重金属为镉或铬。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述含有重金属离子的溶液中，重金属离子的浓度为0.05-1.0mmol/Lo
5.如权利要求1或3或4所述的方法，其特征在于:所述渐渗系水稻RZl为一叶一心期的渐渗系水稻RZl。
6.如权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于:所述渐渗系水稻RZ2为一叶一心期的渐渗系水稻RZ2。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于:所述处理的时间为7天。
所述处理过程中，每天更换新的所述含有重金属离子的溶液。
8.如权利要 求7所述的方法，其特征在于:所述甲基化水平升高为CCGG位点外侧胞嘧啶半甲基化水平升高。
9.权利要求1至8中任一所述方法在水稻育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种诱导渐渗系水稻RZ1和RZ2中的Homebox基因发生甲基化升高的方法。本发明提供的诱导渐渗系水稻RZ1中的Homebox基因发生甲基化水平升高的方法，是用含有重金属离子的溶液处理渐渗系水稻RZ1。本发明提供的诱导渐渗系水稻RZ2中的Homebox基因发生甲基化水平升高的方法，是用含有重金属离子的溶液处理渐渗系水稻RZ2。本发明为进一步研究重金属污染环境中植物的表观遗传变异与植物的抗逆性以及基因组进化的相互关系做铺垫，为培育抗逆重金属水稻新品种提供一定的参考。
文档编号A01G31/00GK103238471SQ20131003265
公开日2013年8月14日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者欧秀芳, 姜丽丽, 徐春明, 庞劲松, 刘宝 申请人:东北师范大学