专利名称：一种提高黄孢原毛平革菌降解性能的培养方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种提高黄孢原毛平革菌降解性能的培养方法。
背景技术：
黄孢原毛平革菌{Phanerochaete chrysosporium)是一类丝状担子菌白腐真菌，含有一套优秀的木质素分解系统。这套优秀的木质素分解系统由系列胞外过氧化物酶组成，典型的酶系如木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。这些胞外过氧化物酶对底物的氧化具有高度非特异性的特点，可以降解多种有机物，包括天然高聚物、还原性化合物、氧化性化合物、有毒化合物等。因此黄孢原毛平革菌在许多生物科技领域中有着广泛的应用价值，如危险废弃物的处理、污染土地的生物修复、生物燃料的制备、生物制浆和生物漂白等。液态沉浸式培养是丝状真菌生长和生产胞外酶的一种最经济的生产方式。为提高丝状真菌一黄孢原毛平革菌液态培养过程中木质素过氧化物酶和催化活性，通常采用以下几种方式:第一种方式是优化培养基，在产酶培养基中控制化学添加剂的种类和剂量，如表面活性剂(如吐温80)、藜芦醇、锰盐、有机酸螯合物、聚丙二醇、磷脂和不饱和酸等；第二种方式是设计不同结构的反应器，如转鼓反应器、翻转生物接触反应器、搅拌罐反应器等；第三种方式是调节控制操作参数，如搅拌转速、温度和光照条件等；第四种方式是改良菌种，如构建高表达和高活性的工程菌种等。上述方法各有千秋，但为进一步提高黄孢原毛平革菌的降解性能拓展其应用研究，新的调控方法仍亟待开发。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高黄孢原毛平革菌降解性能的培养方法。为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下:
一种提高黄孢原毛平革菌降解性能的培养方法，添加无机纳米粒子至黄孢原毛平革菌液体培养基中进行发酵培 养，获得球状黄孢原毛平革菌菌丝团体，所述无机纳米粒子为硅基纳米粒子。上述方案中，所述球状黄孢原毛平革菌菌丝团体内部分布有所述无机纳米粒子。上述方案中，所述发酵培养的具体步骤为:将活化后的黄孢原毛平革菌菌种制备成孢子悬浮液，接种到添加有所述无机纳米粒子的液体培养基中，每升添加有无机纳米粒子的液体培养基中孢子接种量为2.0X IO6 3.0X IO6个，于3(T33°C下摇床培养，摇床转速140 150rpm，培养5 7天。上述方案中，所述无机纳米粒子采用高温高压蒸汽灭菌，所述液体培养基中的组分采用过滤除菌，将所述无机纳米粒子在无菌条件下添加至所述液体培养基中与所述液体培养基中的组分混合。上述方案中，过滤除菌中所用过滤器为0.22微米的微滤膜。上述方案中，所述液体培养基的组分包括:葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.lg/L，藜芦醇0.lg/L，酒石酸铵0.2g/L，及痕量元素溶液70ml/L ；所述痕量元素溶液配方为:硫酸镁3g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钠l.0g/L，七水硫酸亚铁
0.lg/L，氯化钴0.lg/L，硫酸铜0.lg/L，七水硫酸锌0.lg/L，十二水硫酸铝钾10mg/L，硼酸10mg/L, 二水钥酸钠10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。 上述方案中，所述硅基纳米粒子为二氧化硅纳米粒子或硅铝纳米粒子。上述方案中，以IL所述液体培养基为基准，所述无机纳米粒子在所述液体培养基中的添加量为0.0l-1Ogo上述方案中，所述无机纳米粒子的粒径为10-1000nm。本发明所选用的黄孢原毛平革菌菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 14076。本发明的基本 原理:黄孢原毛平革菌生长初期，通过硅基纳米粒子与孢子和菌丝之间的相互作用来影响菌丝球的大小和数量；生长中后期，通过硅基纳米粒子与菌丝球的相互作用，同时硅基纳米粒子进入到菌丝球的内部使其形态和致密度发生变化。纳米粒子与孢子和菌丝球相互作用示意图见图1。本发明有益的效果在于:
(1)添加硅基纳米粒子至液体培养基中，能有效的控制菌丝生长形态，同时由于纳米粒子进入菌丝球的内部，有利于将菌丝球内部更多的活性位点暴露出来，从而提高黄孢原毛平革菌液态培养过程中木质素过氧化物酶和催化活性，进而提高其降解性能，该方法成本低廉，简单易行，效果显著。( 2 )同时，该方法培养获得的菌丝球比表面积大，能有效的提高黄孢原毛平革菌对染料的吸附率。
图1给出了纳米粒子与孢子和菌丝球相互作用示意图。图2给出了实施例1所获得的菌丝球扫描电镜图。图3给出了实施例1的发酵液的蛋白电泳图。图中，1，4-纳米粒子，2-孢子，3-菌丝球，M-蛋白分子量标记，泳道1_对照，泳道2-添加了纳米粒子的发酵结果。
具体实施例方式以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1:
一种提高黄孢原毛平革菌降解性能的培养方法，其包括如下步骤:
(O菌种活化:将黄孢原毛平革菌接种在平板培养基上进行活化培养，培养温度为37°C，待培养2 3天后转入室温下培养至菌丝铺满平板；
(2)添加无机纳米粒子:以IL液体培养基为基准，添加20.0g的SiO2纳米粒子，该纳米粒子的粒径为20nm，以不添加该SiO2纳米粒子的培养基作为对比例；
(3)菌体的培养:将步骤(I)所得的活化后的菌种制备成孢子悬浮液，接种到步骤(2)所得到的添加有SiO2纳米粒子的液体培养基，每升添加有SiO2纳米粒子的液体培养基中孢子接种量为2.0X 106 3.0X IO6个，于30°C下摇床培养，摇床转速150rpm，培养5 7天，得到黄孢原毛平革菌菌丝球的发酵液。其中，步骤(I)中的平板培养基配方为:麦芽粉10g/L，葡萄糖10g/L，胰蛋白胨2g/L，酵母浸膏2g/L，天冬酰胺lg/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁lg/L，琼脂20g/L。步骤(2)中的液体培养基配方为:葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙
0.lg/L,藜芦醇0.lg/L,酒石酸铵0.2g/L,及痕量元素溶液70ml/L ;该痕量元素溶液配方为:硫酸镁3g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钠1.0g/L，七水硫酸亚铁0.lg/L，氯化钴0.lg/L，硫酸铜0.lg/L，七水硫酸锌0.lg/L，十二水硫酸铝钾10mg/L，硼酸10mg/L，二水钥酸钠10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。其中步骤(2)的SiO2纳米粒子采用高温高压蒸汽灭菌，液体培养基中的组分采用过滤除菌，将无机纳米粒子与液体培养基中的组分在无菌条件下混合。过滤除菌中所用过滤器为0.22微米的微滤膜。采用这种灭菌方法可以有效的降低SiO2纳米粒子的团聚。对步骤(3)所得到的发酵液中的菌丝球做扫描电镜(SEM)测试，菌丝球的微观结构见图2。由图2可以看出，SiO2纳米粒子与菌丝互相作用，纳米粒子进入菌丝球的内部，使菌丝球的致密度降低，从而增大了菌丝球的比表面积，故菌丝球的吸附能力增强。同时，添加了纳米粒子的培养基，发酵结束后菌丝球的数量明显增多，结果如表I所示，进一步增加了菌丝球总的比表面积。表I添加纳米粒子后菌丝球数量和大小变化
权利要求
1.一种提高黄孢原毛平革菌降解性能的培养方法，其特征在于，添加无机纳米粒子至黄孢原毛平革菌液体培养基中进行发酵培养，获得球状黄孢原毛平革菌菌丝团体，所述无机纳米粒子为娃基纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述球状黄孢原毛平革菌菌丝团体内部分布有所述无机纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的具体步骤为:将活化后的黄孢原毛平革菌菌种制备成孢子悬浮液，接种到添加有所述无机纳米粒子的液体培养基中，每升添加有无机纳米粒子的液体培养基中孢子接种量为2.0X IO6 3.0X IO6个，于30 33°C下摇床培养，摇床转速14(Tl50rpm，培养5 7天。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述无机纳米粒子采用高温高压蒸汽灭菌，所述液体培养基中的组分采用过滤除菌，将所述无机纳米粒子在无菌条件下添加至所述液体培养基中与所述液体培养基中的组分混合。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，过滤除菌中所用过滤器为0.22微米的微滤膜。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基的组分包括:葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.lg/L，藜芦醇0.lg/L，酒石酸铵0.2g/L，及痕量元素溶液70ml/L;所述痕量元素溶液配方为:硫酸镁3g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钠1.0g/L，七水硫酸亚铁0.lg/L，氯化钴0.lg/L，硫酸铜0.lg/L，七水硫酸锌0.lg/L，十二水硫酸招钾10mg/L,硼酸10mg/L, 二水钥酸钠10mg/L,及氨三乙酸1.5g/L。
7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述硅基纳米粒子为二氧化硅纳米粒子或娃招纳米粒子。
8.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，以IL所述液体培养基为基准，所述无机纳米粒子在所述液 体培养基中的添加量为0.0l-1Og0
9.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述无机纳米粒子的粒径为lO-lOOOnm。
全文摘要
本发明涉及一种提高黄孢原毛平革菌降解性能的培养方法，属于生物工程领域。本发明将硅基纳米粒子添加至黄孢原毛平革菌液体培养基中进行发酵培养，通过硅基纳米粒子与孢子和菌丝之间的作用，同时纳米粒子进入菌丝球内部，获得球状黄孢原毛平革菌菌丝团体，该菌丝团体在染料降解方面具有较佳的应用效果。
文档编号C05G3/00GK103168619SQ20131006770
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月4日 优先权日2013年3月4日
发明者苏宝连, 李其昌, 李昱, 谢浩 申请人:武汉理工大学