三七及屏边三七病程相关功能基因的克隆的制作方法
【专利摘要】本发明涉及三七及屏边三七植物体内的一些病程相关功能基因，该基因系首次利用RT-PCR技术从三七和屏边三七中克隆而得到，详细序列见序列表1。植物在长期进化进程中已发展出一套复杂机制用于抵抗坏境中的有害生物入侵，当病原菌入侵时，抗病相关基因能否被有效诱导以及表达量大小差异是造成寄主植株最终表现为抗病或者感病现象的根本原因。因此，该基因的克隆将有助于揭示三七及其他药用植物抗病分子机理，同时对未来三七抗病新品种的培育也具有着重要的理论指导意义。
【专利说明】三七及屏边三七病程相关功能基因的克隆
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用RT-PCR技术克隆三七及屏边三七病程相关功能基因的一种技 术。
【背景技术】
[0002] 植物病害是农业生产当中所面临的一种主要限制因子，药用植物在其栽培过程中 也同样面临着一样的问题。植物受到病害感染之后，常常表现为严重的连作障碍问题、产量 剧减、药用有效成分降低及品质变劣等一系列问题。
[0003] 三七[Panax notoginseng(Burk)F. H. Chen]为五加科人参属植物，又称"南国神 草"、"金不换"等，是我国重要的名贵中药材之一。三七属于块根入药，有显著的止血、活血 化淤、消肿定痛之功效，其使用历史已有近600年。李时珍《本草纲目》记载：三七性温、微 苦、味甘、归肝、肾、胃经，具有止血化瘀、消肿定痛之功，能治一切血病。
[0004] 三七属于栽培驯化较早的中药材之一，至今为止其人工栽培历史已有400多年。 而这种长期的、规模化的栽培使得三七在自身种植中暴露出很多问题，主要表现为品质降 低、产量不稳定、极易感染病虫害等等。
[0005] 屏边三七[Panax stipuleanatus Η. T. Tsai et K. M. Feng]亦是人参属植物，为 三七近缘植物物种之一，又名"野三七"、"香刺"、"土三七"等。据三七研究院孙玉琴等老师 们长期的观察发现：在同样的生长及栽培环境条件下，发现屏边三七表现为极少感病，基本 上对三七病害免疫。这就为三七抗病基因的挖掘、开发利用提供了可能。
[0006] 最近的几年里，人们克隆到了多个植物抗病基因使得对寄主与病原相互作用分子 机理的研究得到迅速的发展。植物在生长发育过程中常受到一些病原物的侵袭，表现为抗 病或感病，在长期的相互作用及相互选择、协同进化的过程中，植物逐渐获得了一些列复杂 的防御机制来保护自己。这些机制包括植物细胞对病原菌的识别，胞内信号的转换与传导， 防卫反应的开启与系统获得抗性的形成。植物体最终会表现为产生加固和阻止病原生长的 细胞壁成分；合成小分子抑菌物质如植保素（phytoalexin)，毒性酚类小分子化合物；诱导 产生各种病程相关蛋白（pathogenesis related, PR蛋白）如几丁质酶、葡聚糖酶等；蛋白 酶抑制剂的生成；释放各种活性氧；诱导植产生物内原激素等等一系列复杂的生化过程。
[0007] 因此，对植物抗性基因的克隆成为当前研究的热点。自1992年第一个植物R基因 Hml被克隆以来，越来越多植物中的R基因被克隆。在植物抗病基因的克隆工作中，图位克 隆（positional cloning,map-based cloning)和转座子标记技术（transposon tagging) 是常用的两种技术。如玉米抗圆斑病基因 Hml，番茄抗叶霉病基因 Cf-9, Cf-4,烟草抗烟草 花叶病毒基因 N，亚麻抗叶锈基因 L6和M等均是利用转座子标记技术克隆到的抗病基因。大 麦抗白粉病基因 Mlo,番茄抗叶霉病基因 Cf-2,抗叶斑病基因 Pto和Prf基因、抗枯萎病基 因12,拟南芥抗丁香假单胞杆菌基因 RPS2、RPM1，水稻抗白叶枯病基因 Xa21、Xal、抗稻瘟病 基因 Pib均是利用图位克隆技术得到。然而，转座子标签法需要筛选并鉴定突变体、工作量 较大、加之插入位点的不确定性也大大地限制了在其他植物上的应用；图位克隆法则要求 有高密度的分子标记图谱，而药用植物中大都存在有遗传背景不清、分子标记缺失等问题， 这些问题的存在使得想要利用图位克隆技术研究相关基因变得比较困难。
[0008] 从已被克隆R基因来看，虽然这些R基因针对不同的细菌、真菌、病毒和线虫，但它 们的产物却具有着令人惊奇的结构相似性。而且抗性基因常常以基因家族（family)的形 式出现，不同植物中的同类基因之间具有着较高的保守性。这对于那些使用常规基因克隆 技术困难的植物来说，提供了一种克隆抗性基因的途径。本发明通过使用三七近缘属植物 人参、西洋参EST数据，经序列拼接、基因功能注释、KEGG作图，最后成功地克隆出三七和屏 边三七中部分病程相关功能基因，这些基因在其他药用植物研究当中还没有相关报道。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种三七病程相关功能基因克隆的方法。
[0010] 本发明提供了一些病程相关功能基因，它是下列核苷酸序列之一：
[0011] 序列表中R ID No. 1的DNA序列；
[0012] 与序列表中R ID No. 1限定的DNA序列具有一个或几个碱基突变，且编码相同功 能蛋白质的DNA序列。
[0013] -种由上述基因所编码的蛋白质，具有序列表中序列2的氣基酸残基序列或将序 列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代且具有序列2的氨基酸残基序列 相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1病原与植物之间识别KEGG代谢通路图
[0015] 图29个病程相关候选引物在三七及屏边三七中的PCR扩增结果
[0016] 样品编号：M :DL2000DNA marker 由上至下依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、 250bp、100bp ;PN，三七；PS，屏边三七；1，cn ;2，contig27 ;3，contigl56 ;4，contig335 ;5， contig534 ;6, contig552 ;7, contig622 ;8, contig829 ;9, contigl030。
【具体实施方式】
[0017] 1、三七及屏边三七总RNA的提取和检测
[0018] 取云南文山三七（panax notoginseng)及屏边三七（panax stipuleanatus)根 各lg，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，取研磨后的样品〇. Ig置于无 RNase的I. 5ml离 心管中，加入Iml的Trizol至粉碎的样本中，轻轻颠倒混勻，室温放置5min ;4°C条件下 12000rpm离心5min ;取上清至新的EP管中，加入200μ L的氯仿，剧烈震荡约15s，室温条 件下放置3min ;4-C条件下12000rpm离心15min ;取上清至新的EP管中，保证不要吸到组织 碎片。加入500μ L的异丙醇上下轻轻颠倒混勻，室温放置IOmin ;4°C条件下12000rpm离 心IOmin ;此时EP管底部会有白色沉淀，弃上清后，加入IOOOyL的75%乙醇。短暂涡旋后 4°C条件下12000rpm离心Imin去上清后，室温干燥IOmin溶于IOOyL DEPC处理的水中， 用1. 0%琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓 度。置于-80°C冰箱备用。
[0019] 2、逆转录合成cDNA
[0020] 使用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒（北京天根生物技术有限公司）逆转 录合成cDNA。具体操作步骤如下：在冰浴的无核酸酶的离心管中加入2 μ g总RNA、2 μ L 的 01igo(dT)15 引物、2yL 的 SuperPure dNTP(2.5mM each)，补 RNase-Free ddH20 定容 至14. 5μ L ;70°C加热5min后迅速在冰上冷却2min。简短离心后加入以下组分：4μ L的 5XFirst-Strand Buffer，0.5yL RNasin;加入 lyL(200U)TIANScript M-MLV，轻轻用移 液器混匀；42°C温浴50min，然后95°C加热5min终止反应；置于冰上后用RNase-Free CldH2O 将反应体系稀释到50 μ L，置于-20°C冰箱保存。
[0021] 3、病程相关功能基因的获得及引物设计
[0022] 截止6月5号NCBI数据库网站（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)共收录人参 (Panax ginseng)EST 序列 11，412 条、西洋参（Panax quinquefoliusm)EST 序列 5, 018 条。 首先使用EGassembler工具对这些序列进行拼接，具体如下：人参当中的6158条拼接成了 1，304条更长的EST，而另外的5254条无法拼成更长的EST，因此最后总共得到了 6558条拼 接好的序列。这些拼接好的序列用KAAS工具进行KEGG注释。6558个拼接好的序列中1536 个有KEGG注释，分布在278条KEGG通路上，其中和代谢相关的通路有113条；西洋参当中 的2147条拼接成了 539条更长的EST，而另外的2871条无法拼成更长的EST，因此最后总 共得到了 3410条拼接好的序列。这些拼接好的序列用KAAS工具进行KEGG注释。3410个 拼接好的序列中812个有KEGG注释，分布在253条KEGG通路上，其中和代谢相关的通路有 101 条。
[0023] 根据基因注释结果及病原与植物间互作代谢通路图基因分布，最终挑选出9个病 程候选基因。其中7个候选基因的编码区内具有完整的起始密码子和终止密码子，而另外 的2个候选基因仅有起始密码子。使用引物设计软件primer5. 0对具有完整起始密码子和 终止密码子的7个候选基因分别进行引物设计，正向引物位于或者包含起始密码子、反向 引物位于或者包含终止密码子。另外2个候选基因引物设计时，除正向引物包含起始密码 子外，反向引物设计时尽可能靠近3'末端，引物相关详细信息见下表1。
[0024] 表1病程候选基因引物设计详细信息表
[0025]
【权利要求】
1. 病程相关功能基因，它是下列核苷酸序列之一： 1) 序列表1的DNA序列； 2) 由序列表1通过一个或几个核苷酸的添加、删除、取代而得到的序列。
2. 根据权利要求1所述的基因，其特征在于：所述病程相关基因为序列表1所示的核 苷酸序列。
3. 权利要求1所述的基因在三七育种中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK104278039SQ201310273521
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2013年7月2日
【发明者】黄璐琦, 申业, 崔秀明, 李瑞博, 刘玉忠 申请人:中国中医科学院中药研究所