一种内生短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制作方法
【专利摘要】一种内生短短芽孢杆菌可湿性粉剂，由短短芽孢杆菌B-011（保藏号为CGMCCNo.7466）发酵液、滑石粉、木质素磺酸钙、DBS、CMC-Na、糊精及白炭黑按一定比例组成。制备的短短芽孢杆菌B-011可湿性粉剂在25℃室温下芽孢含量为1.8×1010cfu/g、pH6.8、悬浮率76%、润湿时间52s、细度通过率98%、粉剂（4±2）℃贮藏100d存活率达90%，对番茄早疫病具有防治作用，能有效降低化学农药在农业生产的使用率，减少农药对生态环境的破坏，符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治(IPM)的要求。
【专利说明】—种内生短短芽孢杆菌可湿性粉剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物农药领域，具体涉及一种由内生细菌短短芽孢杆菌B-Oll制成的可湿性粉剂。
【背景技术】
[0002]我国每年使用大量的化学农药制剂，极易造成农药残留超标，生物富集，不仅污染生态环境，还影响人类的健康。而生物农药副作用小、对人无害，是一种具有广阔前景的绿色农药，日益成为全球农药发展的一种趋势。
[0003]近年来研究表明，植物内生细菌对许多植物病原生物具有良好的抑制作用，内生细菌的研究已成为植物病害生物防治的一个研究热点，尤其是开发活体微生物可湿性粉剂在现代农药制剂中有广泛的适用范围。
[0004]可湿性粉剂不仅提高了经济效应，又能保护生态环境。本文中的短短芽孢杆菌B-Oll对多种植物病原菌具有很好的抑菌效果，制备的内生短短芽孢杆菌B-Oll可湿性粉剂迄今文献中未见研究报道，为开发短短芽孢杆菌可湿性粉剂的配方筛选奠定了基础。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种内生短短芽孢杆菌可湿性粉剂，其能 有效降低化学农药在农业生产的使用率，减少农药对生态环境的破坏。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:一种内生短短芽孢杆菌可湿性粉剂，所述可湿性粉剂由下列重量百分比的组分组成:短短芽孢杆菌B-Oll发酵液67-75%、滑石粉 9-11%、木质素磺酸钙 6-8%、DBS 1-3%, CMC-Na 1_3%、糊精 0.05-0.15% 及白炭黑 7.6-8.0%。
[0007]最佳的，所述可湿性粉剂由下列重量百分比的组分组成:短短芽孢杆菌B-Oll发酵液70%、滑石粉10%、木质素磺酸钙7%、DBS 3%、CMC-Na 2%、糊精0.1%及白炭黑7.9%。
[0008]上述提及的短短芽孢杆菌B-Oll发酵液是将短短芽孢杆菌CGMCC N0.7466的种子液(种子液的制备为现有常规技术)以0.5-1.5%接种量接种到发酵培养基(发酵培养基组成为:麸皮15g.L-1、豆柏IOg.L—1、酵母膏3g.L—1、及氯化钠7g.L-1)中，初始ρΗ5.5、28-34°C、120-180r/min振荡发酵培养48-60h得到；发酵液中的芽孢含量≥4.0 X 1011，芽孢率≥90%。
[0009]本发明的可湿性粉剂是将内生短短芽孢杆菌B-Oll发酵液与滑石粉按上述比例混合制成母液，鼓风干燥(温度设定60-80°C、时间为72h-80h)，研磨成母粉。在母粉中按比例添加木质素磺酸钙、DBS、CMC-Na、糊精及白炭黑，经喷雾干燥(进风温度170_175°C，出风温度55-60°C)制成。
[0010]本发明对从烟草植物组织中分离得到的内生抗菌细菌-短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis) B-Oll 菌株(该菌株 B-011 已于申请号为 201310194100.8、名称为高效液相色谱法分离纯化植物内生细菌菌株抗菌肽的方法的申请中公开，保藏号为CGMCCN0.7466)进行研究。通过对载体(如膨润土、滑石粉、高岭土、硅藻土及白炭黑)、助剂(润湿剂和分散剂)(十二烷基苯磺酸钠(DBS)、聚乙二醇(PEG8000)、吐温-60、木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、及羧甲基纤维素钠(CMC-Na))、稳定剂(碳酸钙、磷酸氢二钾、及羧甲基纤维素钠(CMC-Na))、保护剂(抗坏血酸(VC)、糊精及十二烷基苯磺酸钠(SDS))的筛选，确定了内生短短芽孢杆菌B-Oll可湿性粉剂最佳配方。
[0011]按照中华人民共和国农药相关国家标准进行测定，结果显示，制备的短短芽孢杆菌B-Oll可湿性粉剂在25°C室温下芽孢含量为1.8X 101Qcfu/g、pH6.8、悬浮率76%、润湿时间52s、细度通过率98%、粉剂(4±2) °C贮藏IOOd存活率达90%。本发明的可湿性粉剂对番茄早疫病菌菌丝及孢子均有致畸作用，对番茄早疫病具有防治作用，能有效降低化学农药在农业生产的使用率，减少农药对生态环境的破坏，符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治(IPM)的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是本发明可湿性粉剂贮藏期芽孢变化图。
[0013]图2是本发明的可湿性粉剂对番茄早疫病菌孢子萌发(40X )的影响图。
[0014]其中:A表示经本发明的可湿性粉剂处理的，B为对照。
【具体实施方式】
[0015]实施例1短短芽孢杆菌B-Oll发酵液的制备
种子液制备:用接种环挑取斜面保存的B-Oll菌株，接入BPY液体培养基中，装液量100ml/250ml，初始 pH6.8，30°C，摇床 180r/min 振荡培养 24h。
[0016]发酵培养:将种子液以1% (V/V)接种量接入装液量100mL/250mL发酵培养基中，30°C振荡培养60h，摇床转速为150r/min。测得发酵液中，芽孢含量> 4.0X 1011，芽孢率
≥ 90%ο
[0017]实施例2
取67kg内生短短芽孢杆菌B-Oll发酵液与Ilkg滑石粉混合制成母液，60°C鼓风干燥80h,研磨成粉,制成母粉，于该母粉中添加8kg木质素磺酸韩、2.85kgDBS、3kgCMC-Na、0.15kg糊精及白炭黑8.0kg，经喷雾干燥(进风温度170°C，出风温度55°C)即得本发明的可湿性粉剂。
[0018]实施例3
取70kg内生短短芽孢杆菌B-Oll发酵液与IOkg滑石粉混合制成母液，70°C鼓风干燥76h,研磨成粉,制成母粉,于该母粉中添加7kg木质素磺酸H3kgDBS、2kgCMC-Na、0.1kg糊精及白炭黑7.9kg，经喷雾干燥(进风温度172°C，出风温度58°C)即得本发明的可湿性粉剂。
[0019]实施例4
取75kg内生短短芽孢杆菌B-Oll发酵液与9.2kg滑石粉混合制成母液，80°C鼓风干燥72h,研磨成粉,制成母粉，于该母粉中添加6.1kg木质素磺酸HlkgDBS、lkgCMC-Na、
0.05kg糊精及白炭黑7.65kg，经喷雾干燥(进风温度175°C，出风温度60°C)即得本发明的可湿性粉剂。
[0020]实施例5短短芽孢杆菌B-011可湿性粉剂稳定性的测定
取100g将实施例3制得的内生短短芽孢杆菌B-Oll可湿性粉剂置于(4±2)°C和室温(25°C)条件下贮存，每IOd测定样品的芽孢含量，测定11次，确定制剂贮存期间芽孢含量的变化。
[0021]本发明的可湿性粉剂在25°C室温、(4±2) °C下贮存IOOd的芽孢含量变化见图1。由图1可知，本发明的制剂在室温25°C下贮藏时的芽孢存活率明显低于(4±2) °C时。本发明的制剂在(4±2) °C贮藏100d，其芽孢存活率可达90%，而在室温贮藏100d，其芽孢存活率下降速度快，仅为70%。
[0022]实施例6本发明的可湿性粉剂对番茄早疫病菌孢子萌发的影响 番茄早疫病菌由湖南农业大学植物病理实验室提供。
[0023]番茄早疫病菌孢子悬浮液的制备:将长满番茄早疫病菌的PDA平板加入无菌水，将孢子洗下，血球板计数法计数，稀释浓度为4.8X107cfu/mL备用。
[0024]I).取番茄早疫病菌孢子悬浮液加入等体积本发明的可湿性粉剂(10_2浓度)混匀，以加无菌水为对照，取1(^1^商加于玻片上，281:无菌保湿1211后观察。取玻片中间及四周5个视野观察孢子形态，并记录孢子总数及萌发数。
[0025]孢子萌发率=孢子萌发数/检查孢子总数X 100%。
[0026]由图2可知，40X显微镜观察，图2B对照图中孢子菌长处细长，而经本发明的可湿性粉剂处理后，番茄早疫病菌孢子萌发完全受到抑制，其萌发率为O。
[0027]2).取Ig本发明的可湿性粉剂，十倍稀释法将该可湿性粉剂稀释为不同浓度(10_2、10' 10_4、10_5、10' 10' 10_8)。加入等体积番茄早疫病菌孢子悬浮液，取玻片中间及四周5个视野观察孢子萌发情况，每处理3次重复。结果显示:经不同浓度本发明的可湿性粉剂处理后，番茄早疫病菌孢子萌发均有不同程度的受到抑制。当浓度在大于10_3时，孢子完全被抑制，本发明可湿性粉剂对番茄早疫病菌孢子萌发MIC为10_3。当浓度小于10_5时，孢子全部萌发。
[0028]由上可知，本发明的可湿性粉剂对番茄早疫病菌具有抑制作用，即对番茄早疫病具有防治作用。
【权利要求】
1.一种内生短短芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述可湿性粉剂由下列重量百分比的组分组成:短短芽孢杆菌B-Oll发酵液67-75%、滑石粉9-11%、木质素磺酸钙6_8%、DBS1-3%、CMC-Na 1_3%、糊精 0.05-0.15% 及白炭黑 7.6-8.0%。
2.如权利要求1所述的一种内生短短芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述可湿性粉剂由下列重量百分比的组分组成:短短芽孢杆菌B-Oll发酵液70%、滑石粉10%、木质素磺酸钙 7%、DBS 3%、CMC-Na 2%、糊精 0.1% 及白炭黑 7.9%。
3.如权利要求1或2所述的一种内生短短芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述短短芽孢杆菌B-Oll发酵液中的芽孢含量≥4.0X IO110
4.如权利要求1或2所述的一种内生短短芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述短短芽孢杆菌B-Oll发酵液制备时所用发酵培养基组成为:麸皮15g.L_\豆柏IOg.L_\酵母膏3g.L'及氯化钠7g.L'
5.权利要求1或2所述的内生短短芽孢杆菌可湿性粉剂在制备防治番茄早疫病的药物中的应用。
【文档编号】A01N63/02GK103704273SQ201410013801
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】易有金, 田 健, 李舒雯 申请人:湖南农业大学