一种草莓组织培养方法
【专利摘要】本发明公开一种草莓组织培养方法，属于农业生物组织培养【技术领域】，其包括以下步骤：步骤一、选择外植体：于5~6月份晴天的下午，取健壮、无病草莓植株刚抽出的匍匐茎茎尖，大小为0.3~0.4mm，作为组织培养的外植体茎尖；步骤二、准备培养基：1）分化培养基；2）继代培固体养基；3）诱导生根培固体养基；步骤三、灭菌；步骤四、接种；步骤五、组培苗移栽。本发明的草莓组织培养方法，通过选择升汞作为灭菌剂，杀菌能力较强，并且时间容易控制把握；通过选择不定根直接生自茎基且多而粗壮，3片叶以上且大而深绿的生根苗，使得成活率普遍较高；本方法不仅整体的操作过程较为简单，实施起来较容易，而且能够快速大量繁殖草莓脱毒苗，具备很好的实用性。
【专利说明】一种草莓组织培养方法 发明领域
[0001] 本发明属于农业生物组织培养【技术领域】，具体涉及一种草莓组织培养方法。
【背景技术】
[0002] 草莓作为应时鲜果以其突出的经济价值和生态功能在我国得到大面积的推广种 植。由于种植草莓多采用无性繁殖，容易感染多种病毒。主要是草莓斑驳病毒、草莓轻性黄 边病毒，草莓皱缩病毒和草莓镶脉病毒，草莓病毒病给草莓生产造成严重的危害，使草莓减 产，严重影响生产。
[0003] 由于生产生活需要和现有的栽培条件限制，产量高、品质好及抗性强的优质草莓 脱毒苗的生产和育种困难。
【发明内容】
[0004] 发明目的：本发明的目的在于提供一种草莓组织培养方法，使得制备的草莓脱毒 苗品质好，成活率高，草莓的产量高。
[0005] 技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案： 一种草莓组织培养方法，包括以下步骤： 步骤一、选择外植体： 于5飞月份晴天的下午，取健壮、无病草莓植株刚抽出的匍匐茎茎尖，大小为 0. 3~0. 4mm，作为组织培养的外植体茎尖； 步骤二、准备培养基： 1) 分化培养基：用于草莓茎尖培养诱导芽分化阶段的基本培养基为MS培养基，附加 6-BA 0· 5mg/L，NAA 0· 2mg/L，蔗糖 30g/L，琼脂粉 6. 5g/L，并调节培养基 pH 值为 5. 8?6. 0 ; 2) 继代培固体养基：用于草莓茎尖的扩大繁殖阶段的基本培养基采用MS培养基附加 6-BA 0· 5mg/L、NAA 0· 01mg/L，调节培养基 pH 值为 5. 8?6. 0 ; 3) 诱导生根培固体养基：待幼苗长至2cm以上，即可切下单株转移至生根培养基为 1/2MS培养基附加0· 2mg/L的NAA，调节培养基pH值为5. 8?6. 0 ; 步骤三、灭菌： 将步骤一中得到的组织培养的外植体茎尖用0. 1%升汞水溶液浸泡茎尖8~10分钟，并 每隔2分钟摇晃一次，完成灭菌； 步骤四、接种： 在培养室中，将步骤二中的培养基放置于培养瓶中，将步骤三得到的灭菌后的茎尖，转 移至步骤二中得到的分化培养基中；待愈伤组织长出小植株时，切取绿色部分且含有小苗 的组织转移至继代培养基中进行扩大繁殖阶段；待幼苗长至2cm以上，即可切下单株转移 至诱导生根培养基中；上述的培养条件均为25±2°C，每日光照12小时，光强度2000Lx ; 步骤五、组培苗移栽： 移栽前将培养瓶从培养室中取出置于自然条件下，打开瓶盖进行透气炼苗；24小时 后，从瓶中取出幼苗，清除根部及根颈处的培养基，并移栽至苗圃或穴盘中进行驯化。
[0006] 步骤二中，所述的培养基须用1~1. 1个大气压热压灭菌20分钟。
[0007] 步骤三中，所述的灭菌后的茎尖，再用无菌水充分清洗:Γ5次，清除残余的升汞。
[0008] 步骤五中，所述的苗圃或穴盘中的基质采用经过灭菌处理的腐熟的锯木屑或腐叶 土，或采用经过灭菌处理的由蛭石与珍珠岩按体积计以1 :1比例配成的混合物，或采用园 土与煤渣按体积计以2 :1比例配制成的混合物。
[0009] 所述的基质要用清水冲洗干净或用多菌灵或甲基托布津掺拌灭菌；用煤渣作基质 时，还要用0. 2%冰乙酸中和煤渣使碱性降低。
[0010] 步骤五中，所述的小苗驯化时，放在温室内或塑料拱棚内培养，温度控制在 15?201：，湿度维持在80%。
[0011] 有益效果：与现有技术相比，本发明的草莓组织培养方法，通过选择升汞作为灭菌 齐U，杀菌能力较强，并且时间容易控制把握；通过选择不定根直接生自茎基且多而粗壮，3 片叶以上且大而深绿的生根苗，使得成活率普遍较高；本方法不仅整体的操作过程较为简 单，实施起来较容易，而且能够快速大量繁殖草莓脱毒苗，具备很好的实用性。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0013] 一种草莓组织培养方法，由以下步骤来完成：步骤一，外植体选择；步骤二，培养 基准备；步骤三，灭菌；步骤四，接种；步骤五，组苗移栽。
[0014] 在步骤一中，于5飞月份晴天的下午，取健壮、无病草莓植株刚抽出的匍匐茎茎 尖，大小为0. 3~0. 4mm，作为组织培养的外植体。
[0015] 在步骤二中，将上述步骤一所取的茎尖经过不同灭菌剂处理并用无菌水清洗后， 转移至分化培养基(用于草莓茎尖培养诱导芽分化的基本培养基为MS，附加6-BAO. 5mg/L， NAAO. 2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉6. 5g/L，pH值调至5. 8?6. 0);培养条件为25±2°C，每日 光照12小时，光强度2000Lx为宜。待愈伤组织长出小植株时，切取绿色部分且含有小苗的 组织转移至继代培养基中进行扩大繁殖阶段(继代培养基采用MS培养基附加6-BAO. 5mg/ L、NAA0. 01mg/L)。待幼苗长至2cm以上，即可切下单株转移至生根培养基中（诱导生根培养 基用1/2MS附加0. 2mg/L的NAA)，在移苗过程中去掉原生叶片更有利于新苗分化，在扩大繁 殖中及时清除愈伤组织，有利于新苗增殖和生长。
[0016] 在步骤三中，使用以下几种灭菌剂的进行分别灭菌。（1)10%的过次氯酸钠水溶液 (含有效氯0. 4-0. 5 % )，浸泡接种材料10-15分钟；（2 )饱和次氯酸钙，浸泡接种材料15-30 分钟；（3) 10-12%的过氧化氢水溶液浸泡10-20分钟；（4)5-10%的新洁尔灭水溶液，浸泡 10-15分钟；（5)0. 1 %的升汞水溶液，浸泡8-10分钟；其中前4种灭菌剂对接种材料比较 安全，但因灭菌时间较长，常常使接种材料的外层氧化变褐，以致影响培养效果；升汞有很 强的杀菌能力，但浸泡时间稍长会造成接种材料中毒；因此，在草莓组织培养中，把握好升 汞的处理时间可达到更佳灭菌效果；灭菌后的接种材料，要用无菌水充分清洗3-5次。
[0017] 在步骤四中，以培养无病毒苗为主要目的的草莓组织培养，所接种的茎尖材料很 小，在接种时要求能够准确熟练地剥取茎尖生长点，并使用固体培养基比较适宜，接种时应 注意不能将整个茎尖埋入培养基中；培养基须用1~1. 1个大气压热压灭菌20分钟。从材料 接种到生根苗长成，这期间的培养温度一般应稳定在25±2°C。每日光照12小时，光强度 2000Lx 为宜。
[0018] 在步骤五中，待幼苗长出根后，需进行移栽。移栽前要将培养瓶从培养室中取出置 于自然条件下，打开瓶盖进行透气炼苗。24小时后，从瓶中取出幼苗，清除干净根部及根颈 处的培养基，然后移栽至苗圃或穴盘中进行驯化。基质可采用经过灭菌处理的腐熟锯木屑 或腐叶土，也可采用经过灭菌处理的由蛭石与珍珠岩按体积计以1 :1比例配成的混合物， 或园土与煤渣按体积计以2 :1比例配制成的混合物。栽培基质要用清水冲洗干净，或用多 菌灵或甲基托布津掺拌灭菌，用煤渣作基质时，还要用〇. 2%冰乙酸中和使碱性降低。移栽 时采取"深栽浅埋"。深栽就是在移栽时根要栽得深，浅埋的标准是使小苗的根颈与土表平 齐，或略高于土表。注意控制光照与温度、湿度。小苗移栽后，放在温室内或塑料拱棚内培 养，温度控制在15-20°C，湿度维持在80%左右为宜。同时由于刚移栽的小苗茎杆脆嫩，应 尽量采用喷雾状浇水，水量也不宜过大，落干后再喷。遮光50 %，一周后，可逐渐增强日光照 射。
【权利要求】
1. 一种草莓组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一、选择外植体： 于5飞月份晴天的下午，取健壮、无病草莓植株刚抽出的匍匐茎茎尖，大小为 0. 3~0. 4mm，作为组织培养的外植体茎尖； 步骤二、准备培养基： 1) 分化培养基：用于草莓茎尖培养诱导芽分化阶段的基本培养基为MS培养基，附加 6-BA 0· 5mg/L，NAA 0· 2mg/L，蔗糖 30g/L，琼脂粉 6. 5g/L，并调节培养基 pH 值为 5. 8?6. 0 ; 2) 继代培固体养基：用于草莓茎尖的扩大繁殖阶段的基本培养基采用MS培养基附加 6-BA 0· 5mg/L、NAA 0· 01mg/L，调节培养基 pH 值为 5. 8?6. 0 ; 3) 诱导生根培固体养基：待幼苗长至2cm以上，即可切下单株转移至生根培养基为 1/2MS培养基附加0· 2mg/L的NAA，调节培养基pH值为5. 8?6. 0 ; 步骤三、灭菌： 将步骤一中得到的组织培养的外植体茎尖用0. 1%升汞水溶液浸泡茎尖8~10分钟，并 每隔2分钟摇晃一次，完成灭菌； 步骤四、接种： 在培养室中，将步骤二中的培养基放置于培养瓶中，将步骤三得到的灭菌后的茎尖，转 移至步骤二中得到的分化培养基中；待愈伤组织长出小植株时，切取绿色部分且含有小苗 的组织转移至继代培养基中进行扩大繁殖阶段；待幼苗长至2cm以上，即可切下单株转移 至诱导生根培养基中；上述的培养条件均为25±2°C，每日光照12小时，光强度2000Lx ; 步骤五、组培苗移栽： 移栽前将培养瓶从培养室中取出置于自然条件下，打开瓶盖进行透气炼苗；24小时 后，从瓶中取出幼苗，清除根部及根颈处的培养基，并移栽至苗圃或穴盘中进行驯化。
2. 根据权利要求1所述的草莓组织培养方法，其特征在于：步骤二中，所述的培养基须 用1~1. 1个大气压热压灭菌20分钟。
3. 根据权利要求1所述的草莓组织培养方法，其特征在于：步骤三中，所述的灭菌后的 茎尖，再用无菌水充分清洗:Γ5次，清除残余的升汞。
4. 根据权利要求1所述的草莓组织培养方法，其特征在于：步骤五中，所述的苗圃或穴 盘中的基质采用经过灭菌处理的腐熟的锯木屑或腐叶土，或采用经过灭菌处理的由蛭石与 珍珠岩按体积计以1 :1比例配成的混合物，或采用园土与煤渣按体积计以2 :1比例配制成 的混合物。
5. 根据权利要求4所述的草莓组织培养方法，其特征在于：所述的基质要用清水冲洗 干净或用多菌灵或甲基托布津掺拌灭菌；用煤渣作基质时，还要用〇. 2%冰乙酸中和煤渣使 碱性降低。
6. 根据权利要求1所述的草莓组织培养方法，其特征在于：步骤五中，所述的小苗驯化 时，放在温室内或塑料拱棚内培养，温度控制在15~20°C，湿度维持在80%。
【文档编号】A01H4/00GK104186351SQ201410490882
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】胡德龙, 颜志明, 王全智, 谭晓燕, 陆建兰, 蔡善亚 申请人:江苏农林职业技术学院