一种基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽培方法
【专利摘要】本发明属海洋植物栽培领域，涉及一种基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽培方法，是以野生型和人工养殖琼枝麒麟菜为材料，用果胶酶和鲍鱼消化道粗提酶混合液酶解获得原生质体，经诱导原生质体融合获得杂合细胞，最后通过植物激素诱导培养杂合细胞获得的新植株。本发明工艺简单，可操作性强，利用野生和人工养殖的两类琼枝麒麟菜的原生质体进行融合，获得杂合细胞，再诱导分化出完整植株的细胞杂交技术，获得的新植株具有养殖周期短和抗逆性强的特点，可为琼枝麒麟菜的产业化发展提供技术支持，可有效提高琼枝麒麟菜养殖的经济和生态价值，具有现实意义。
【专利说明】一种基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽培方法
【技术领域】
[0001] 本发明属海洋植物栽培领域，涉及一种细胞杂交栽培方法，具体是一种基于野生 型琼枝麒麟菜和人工养殖琼枝麒麟菜间的细胞杂交栽培方法。
【背景技术】
[0002]琼枝麒麟菜（Betaphycus gelatinum)隶属于红藻门（Rhodophyta)、真红藻 纲（F lorideae)、杉藻目（G igartina-les)、红翔菜科（Solieriaceae)、琼枝藻属 (Betaphycus)，是海南一种特有的海洋红藻，具有低脂肪、低热量、高纤维、富含矿物质、微 量元素和卡拉胶等特点，广泛用作天然绿色保健食品、大型经济海洋贝类的饵料和提取卡 拉胶的化工原料，同时由于其生长过程中需吸收海水中的大量营养物质，对海洋生态环境 起到良好的保护和修复作用，因此具有重要的经济价值和生态价值，在食品、医药、日化及 其它科研领域具有极为重要的应用。
[0003]由于琼枝麒麟菜具有很高的经济价值，国内外市场的需求量大，目前，我国海南省 是琼枝麒麟菜的主产地之一，且大部分产量为野生采捞。由于采捞过度，以及在采捞过程中 对珊瑚礁的不断破坏，野生琼枝麒麟菜的资源日益减少，人工养殖已成为提高琼枝麒麟菜 供应量的重要方式。但人工养殖的琼枝麒麟菜常因生长周期较长（约3个月收获1次）和 抗逆性差（盐度低于20%。时藻体大量死亡）而使养殖效益受到显著影响。如何缩短养殖周 期和增强抗逆性已成为琼枝麒麟菜养殖产业亟待解决的问题。
[0004] 细胞杂交是指用人工的方法把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导融合成 杂合细胞，再经离体培养，诱导分化出完整植株的整个过程。大量研究表明原生质体融合可 使海藻细胞进行杂交，为有效地培育和改良具有各种优良性状的经济海藻开辟新的途径， 因而广泛应用于各种经济海藻的性状改良。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽 培方法，利用野生和人工养殖的两类琼枝麒麟菜的原生质体进行融合，获得杂合细胞，再诱 导分化出完整植株的细胞杂交技术，获得的新植株具有的养殖周期短和抗逆性强的特点。
[0006] 本发明所采用的技术方案：
[0007] -种基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽培方法，其步骤如下：
[0008] 1、原生质体的分离
[0009] 选取野生种和人工养殖种琼枝麒麟菜的新鲜藻体，经消毒灭菌处理后加入混合酶 液，在光照< 5001ux和温度20-25°C的条件下，酶解1. 5?2h，获得两种琼枝麒麟菜的原生 质体。所述混合酶液是指在酶液中含有2%的果胶酶、3. 5%的鲍鱼消化道粗提酶和5mmol/ L葡萄糖酸钠，pH为6. 5。
[0010] 所述鲍鱼消化道粗提酶是取新鲜鲍鱼消化道组织，重蒸水清洗干净，冷冻干燥，研 钵中研磨成细粉，过60目筛，然后按5mL/g的加入量加入事先冷冻的0. 05mol/L磷酸缓冲 液（pH 7. 8)，超声波（功率20kHz)辅助提取20min，最后，低温离心（10000r/min)10min取 上清液，即为鲍鱼消化道粗提酶液。
[0011] 2、原生质体的融合
[0012] 将分离得到的原生质体，洗涤液洗涤干净，用f/2培养液分别制成原生质体浓度 为10 4?105个/mL的原生质体悬液，再加入CaCl2. H202、Mg Cl2. H202，使其浓度分别为5mmol/ L;然后将两种原生质体悬浮液按1:1比例混合，加入PEG (聚乙二醇）诱导两种原生质体融 合。
[0013] 所述的诱导原生质体融合是在混合原生质体悬浮液中加入PEG5000(分子量为 5000的聚乙二醇），使其浓度达到30%，处理时间为15min，处理温度25?28°C，光照条件 为彡 5001ux。
[0014] 3、杂种细胞的选择
[0015] 将含融合细胞的原生质体悬液加到培养皿中，40°C保温，加入含0. 8%琼脂糖的 f/2培养液充分混匀，然后室温冷却凝固。显微镜下识别融合细胞，并做好标记。
[0016] 4、杂合细胞的培养
[0017] 挑取单个已融合的细胞，用杂合培养液进行培养，直至融合细胞开始分裂并形成 2. 5?3cm细胞团。所述杂合培养液是以f/2培养液为基础培养液，并添加2, 4-D 0. 5 y g/ L、6-BA 0.25iig/L、琼胶 0.5%。
[0018] 5、杂合细胞诱导再生植株
[0019] 将形成的细胞团移入诱导培养液中通气培养，诱导细胞团生成新的植株。所述诱 导培养液是以f/2培养液为基础培养液，并添加6-BA 0. 25 y g/L、IBA 0. 1 y g/L。
[0020] 本发明工艺简单，利用野生和人工养殖的两类琼枝麒麟菜的原生质体进行融合， 获得杂种细胞，再诱导分化出完整植株的细胞杂交技术，获得的新植株具有养殖周期短和 抗逆性强的特点，可为琼枝麒麟菜的产业化发展提供技术支持，具有现实意义。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例用于 说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022] 实施例一
[0023] 1、原生质体的分离：取采自海南三沙海域的野生种和文昌海域的人工养殖种琼枝 麒麟菜的新鲜藻段，消毒海水洗去表面污物，在含〇. 5% KI的消毒海水中浸泡5min，再用消 毒海水冲洗3次，分别用消毒刀片细切成大小为1_2左右的碎段，然后加入混合酶液（2% 的果胶酶、3. 5%的鲍鱼消化道粗提酶和5mmol/L葡萄糖酸钠，pH为6. 5)充分混匀，在暗黑 (光照< 5001UX)和温度20°C的条件下，酶解2h。酶解完毕，用孔径30 y m的筛絹过滤，去 除未解壁的细胞团，滤液2000r/min离心分离5min，获得两种琼枝麒麟菜的原生质体。
[0024] 2、原生质体的融合：原生质体用含有0. 5mol/L甘露醇的海水洗涤3次，用f/2培 养液（含 5mmol/LCaCl2. H202 和 5mmol/LMg Cl2. H202, pH 为 6. 0)制成浓度约为 104-105 个 / mL的原生质体悬液；其中野生型琼枝麒麟菜原生质体用0. 01 %中性红染色5min。将两种 原生质体悬浮液按1:1比例混合，加入（分子量为5000的聚乙二醇）PEG5000,使其浓度达 到30%，在温度25°C和弱光条件下，处理15min，诱导原生质体融合。然后用含有0. 5mol/L 甘露醇的海水洗涤3次并低速离心（1000r/min)以去除PEG5000。
[0025] 3、杂合细胞的选择：将0. 5mL含融合细胞的原生质体悬液稀释10倍分别加到10 个直径为12cm的培养皿中，40°C保温，加入含0. 8%琼脂糖的f/2培养液10mL充分混匀，然 后室温冷却凝固。显微镜下识别融合细胞，并做好标记。记录试验数据，结果见表1。
[0026] 表1原生质体的融合效果
[0027]
【权利要求】
1. 一种基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽培方法，其特征在于，其步骤如下： 1) 、原生质体的分离 选取野生种和人工养殖种琼枝麒麟菜的新鲜藻体，经消毒灭菌处理后加入混合酶液， 在光照< 5001ux和温度20-25°C的条件下，酶解1. 5?2h，获得两种琼枝麒麟菜的原生质 体；所述混合酶液是指在酶液中含有2%的果胶酶、3. 5%的鲍鱼消化道粗提酶和5mmol/L 葡萄糖酸钠，pH为6.5 ; 2) 、原生质体的融合 将分离得到的原生质体，洗涤液洗涤干净，用f/2培养液分别制成原生质体浓度为 104?105个/mL的原生质体悬液，再加入CaCl2. H202、Mg Cl2. H202，使其浓度分别为5mmol/ L ;然后将两种原生质体悬浮液按1:1比例混合，加入PEG诱导两种原生质体融合； 3) 、杂种细胞的选择 将含融合细胞的原生质体悬液加到培养皿中，40°C保温，加入含0. 8%琼脂糖的f/2培 养液充分混匀，然后室温冷却凝固；显微镜下识别融合细胞，并做好标记； 4) 、杂合细胞的培养 挑取单个已融合的细胞，用杂合培养液进行培养，直至融合细胞开始分裂并形成 2. 5?3cm细胞团；所述杂合培养液是以f/2培养液为基础培养液，并添加2, 4-D 0. 5 y g/ L、6-BA 0? 25 ii g/L、琼胶 0? 5% ; 5) 、杂合细胞诱导再生植株 将形成的细胞团移入诱导培养液中通气培养，诱导细胞团生成新的植株；所述诱导培 养液是以f/2培养液为基础培养液，并添加6-BA 0. 25 y g/L、IBA0. 1 y g/L。
2. 根据权利要求1所述的基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽培方法，其特征在于：所述鲍 鱼消化道粗提酶是取新鲜鲍鱼消化道组织，重蒸水清洗干净，冷冻干燥，研钵中研磨成细 粉，过60目筛，然后按5mL/g的加入量加入事先冷冻的0. 05mol/L磷酸缓冲液，超声波辅助 提取20min，最后，低温离心lOmin取上清液，即为鲍鱼消化道粗提酶液。
3. 根据权利要求1所述的基于琼枝麒麟菜的细胞杂交栽培方法，其特征在于：所述的 诱导原生质体融合是在混合原生质体悬浮液中加入PEG5000,使其浓度达到30 %，处理时 间为15min，处理温度25?28°C，光照条件为彡5001ux。
【文档编号】A01H4/00GK104450672SQ201410727000
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】黄勃, 王小兵, 段泽林 申请人:海南大学