一种脐血造血干细胞冻存管的制作方法

本发明属于干细胞领域，具体涉及一种脐血造血干细胞冻存管。

背景技术：

脐血干细胞是脐血中的一种具有分化潜能的原始细胞，具备自我更新和增殖的能力，并能在特定因素的影响或诱导下，向各种细胞或组织分化。脐血造血干/祖细胞具有高度的自我更新能力或复制能力，能保持干细胞数量恒定，并能进一步分化为各系祖细胞及成熟细胞。CD34抗原是分离纯化造血干/祖细胞的主要标志，脐血中的CD34+细胞群在数量、质量和增殖能力方面高于外周血，脐血中的造血干/祖细胞具有更原始、更强的增殖分化能力。近年来，脐血造血干细胞移植已发展为一种高科技生物治疗手段，广泛应用于许多疾病的治疗，包括恶性血液病、自身免疫性疾病、严重免疫缺陷症等，临床证明具有一定的疗效。

冷冻保存是脐血保存和造血干细胞移植的关键。已知，脐血干细胞在液氮中冻存6个月、1年、2年后的数量和活性无明显变化，冻存效果较好，因而建议脐血干细胞长期保存应置于液氮中。鉴于-80℃冻存的方法方便、成本较低、应用广泛，6个月以内的冻存采用-80℃冻存更为方便。徐长根等研究(-80℃下不同冻存时间对脐血造血干细胞保存效果的影响，临床输血与检验2010年4月第12卷第2期)发现，脐血细胞在-80℃下保存1、2、3、4、8周后，各组的有核细胞数和CD34+数的差异无统计学意义，而在冻存16、32周后较1周的差异有统计学意义(P<0.05)。台盼蓝拒染率在8、16、32周较1周的差异均有统计学意义(P<0.05)。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种脐血造血干细胞冻存管，用于脐血造血干细胞在-80℃条件下6个月以内的有效冻存。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

一种脐血造血干细胞冻存管，包括冻存管主体，该冻存管主体的内壁设有包被层，包被层为γ聚谷氨酸材质。

优选地，所述γ聚谷氨酸的分子量为70万克/摩尔。

优选地，γ聚谷氨酸包被层的厚度为0.2-0.4mm。

一种制备上述脐血造血干细胞冻存管的方法，包括如下步骤：

步骤S1，将无菌γ聚谷氨酸溶于无菌水中，制成浓度为0.1-0.2mg/mL的γ聚谷氨酸溶液，用0.22μm滤膜过滤，备用；

步骤S2，取上述γ聚谷氨酸溶液加入市售冻存管中，置于35-45℃无菌条件静置2-4小时；

步骤S3，倾倒冻存管中剩余溶液，用无菌水清洗2-3次，置于无菌条件备用。

本发明的有益效果：

本发明提供的冻存管内壁含有γ聚谷氨酸包被层，使用本发明冻存管冻存脐血造血干细胞时，-80℃冻存6个月细胞数量和活性无明显下降，显著优于现有技术。因此，脐血造血干细胞6个月内的短期保存可以使用本发明提供的冻存管在-80℃冻存；超过6个月的长期冻存建议使用液氮保存。

附图说明

图1为本发明冻存管结构示意图，图中1为γ聚谷氨酸包被层；

图2为包被冻存组和常规冻存组6个月冻存期内台盼蓝拒染率变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图详细介绍本发明的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知。

实施例1本发明冻存管的制备

取市售2mL康宁冻存管自制本发明提供的冻存管，具体步骤如下：

步骤S1，将无菌γ聚谷氨酸(采用γ射线钴60照射灭菌，分子量70万克/摩尔)溶于无菌水中，制成浓度为0.15mg/mL的γ聚谷氨酸溶液，用0.22μm滤膜过滤，备用；

步骤S2，取2mLγ聚谷氨酸溶液加入2mL康宁冻存管中，于40℃无菌条件静置3小时；

步骤S3，倾倒冻存管中剩余溶液，用无菌水清洗3次，置于无菌条件备用。

显微镜观察显示，冻存管内壁形成均匀的γ聚谷氨酸包被层，包被层厚度0.3mm。

γ聚谷氨酸溶液的浓度可以在0.1-0.2mg/mL之间调整，静置温度在35-45℃之间调整，静置时间4-5小时，最终获得的包被冻存管内壁的γ聚谷氨酸包被层厚度在0.2-0.4mm之间。

其他规格的冻存管制备方法类似。

当然，为了提高科研人员的工作效率，可以制备成预包被冻存管成品销售给科研人员。

实施例2冻存管内壁包被对冻存效果的影响

一、实验方法

1、脐血造血干细胞分离

肝素抗凝的脐血用Ficoll作密度梯度离心获得脐血单个核细胞，洗涤后用RPMI 1640培养液制成细胞悬液，并调整细胞浓度为5×10¹⁰/L。

2、低温冻存

采用含5％DMSO(二甲基亚砜，体积百分浓度)、3％HES(羟乙基淀粉，质量体积百分浓度)和4％HSA(人血白蛋白，质量体积百分浓度)的RPMI 1640培养液作为细胞冷冻保护剂，在试管中将等体积的细胞冷冻保护剂(4℃预冷)缓慢加入细胞悬液(4℃预冷)中，边加边混匀，然后分装于2ml的冻存管中。在4℃冰箱中平衡30min后置于-80℃冰箱直接冻存，分别冻存0.5、1、3、6个月后42℃快速复温并检测各项指标。

实验分为包被冻存组和常规冻存组，包被冻存组采用实施例1制备的γ聚谷氨酸包被冻存管，常规冻存组直接使用市售的常规冻存管。每组每个时间点设5个重复。

3、指标检测

有核细胞计数：用白细胞稀释液稀释细胞悬液后，血细胞计数板计数，重复3次取均值。

流式细胞仪检测CD34+：取50μl有核细胞悬液，加入20μl FITC标记的抗CD34+抗体，阴性对照加入20μl鼠IgG1-FITC，避光室温孵育20min，用PBS洗3次，最后加0.5ml含0.1％多聚甲醛的PBS，上机分析。在FSC-SSC散点图上，以阴性对照设门(淋巴细胞群)，在FITC荧光参数直方图上设定阴性。分析软件为Cellquest。

采用台盼蓝拒染法进行活细胞计数：取0.5ml细胞悬液置于EP管，再加入约0.1ml 0.5％台盼蓝染液，混合2min后制片，镜检。采用血细胞计数板计数，计算台盼蓝拒染率。

应用SPSS 11.0软件，采用单因素方差分析实验数据。

二、实验结果

包被冻存组和常规冻存组脐血造血干细胞冻存0.5、1、3、6个月后有核细胞数、CD34+阳性细胞数和台盼蓝拒染率(％)见表1和图2。

表1各指标检测结果(n＝5)

表1和图2表明，包被有γ聚谷氨酸的冻存管对脐血造血干细胞具有冻存保护作用，在6个月冻存期间，其有核细胞数、CD34+阳性细胞数和台盼蓝拒染率(细胞存活率)均没有显著变化。而使用常规无γ聚谷氨酸包被层的冻存管冻存脐血造血干细胞时，虽然0.5月、1月细胞数量和活性无明显下降，但是3月细胞数量和活性显著下降，6月下降更明显。因此，脐血造血干细胞6个月内的短期保存可以使用本发明提供的冻存管在-80℃冻存；超过6个月的长期冻存建议使用液氮保存。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。