本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种贵港报春苣苔的组织培养方法。
背景技术：
贵港报春苣苔(primulinaguigangensis)为苦苣苔科报春苣苔属的多年生草本植物。该种2011年于广西贵港市樟木镇首次发现。贵港报春苣苔生于海拔160米的石灰岩山区，能够适应每年显著的干湿季节交替，由于其对环境的要求仍较苛刻，生态位极为狭小，种群数量正在逐渐减少。开展人工繁殖研究是保护物种的基础。贵港报春苣苔的繁殖可采用种子繁殖和扦插繁殖，但种子繁殖常受种源及发芽率的影响，而贵港报春苣苔又没有伸长的茎干用于扦插，因此叶片扦插是最简单常用的繁殖方法。叶片扦插繁殖速度慢，繁殖系数小，而组织培养具有快速且易成规模，成品苗品质优良整齐的优点，是人工繁殖的有效途径。
目前，组织培养方法已在报春苣苔属的其他植物上有相关研究，但该种的组织培养研究尚未有相关报道。因此，建立贵港报春苣苔的组织培养体系，对进一步保护和利用该物种具有十分重要的意义。
技术实现要素：
针对现有的贵港报春苣苔繁育技术的匮乏与不足，本发明提供一种贵港报春苣苔的组织培养方法，从而可以达到进一步保护和利用该物种的目的。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种贵港报春苣苔的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：于春季取贵港报春苣苔带叶柄的幼嫩叶片，先用洗衣粉浸泡10-15min后在流水下冲洗干净10-15min，并用软毛刷轻轻刷洗叶片；在超净工作台上先用棉球蘸取70％酒精拭擦叶片表面，无菌蒸馏水冲洗3-5次，将叶片在75％酒精中浸泡10-12s，无菌蒸馏水冲洗3-5次，再用0.1％升汞溶液处理8-10min，无菌蒸馏水冲洗3-5次；灭菌过程中轻轻震荡使酒精或升汞充分接触叶片；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100ml0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；
(2)初代诱导：将消毒灭菌好的叶片切下叶柄，余下的叶片按照以下方法切割：横切、纵切，切下的叶片要求四周切去少许组织，保证四周均有切口；然后将叶柄接入初代培养基中培养25-30d，得到愈伤组织；将横切叶片和纵切叶片接入初代培养基中培养24-30d，诱导出不定芽和愈伤组织；要求叶柄、叶片的正面朝上，叶背朝下，使叶背接触培养基；
(3)增殖培养：将从叶片直接获得的具有1对以上叶片的不定芽接入增殖培养基中培养28-35d；
(4)愈伤组织分化：将从叶片或叶柄诱导出来的愈伤组织切成1cm×1cm大小，然后接入分化培养基中培养30-32d；
(5)壮苗培养：当组培苗具有2对以上叶片时，转接于壮苗培养基中培养15-18d；
(6)生根培养：选取生长健壮，具有2对以上叶片的植株，转接于生根培养基中培养25-28d。
作为优选，步骤(2)中所述的横切是在叶片中部位置垂直中脉切下，将叶片一分为二；所述的纵切是沿着叶片中脉将叶片切为两部分。
作为优选，步骤(2)中用于叶柄的愈伤组织诱导培养基为：ms+6-ba3-5mg/l+2,4-d0.5-1.0mg/l。
作为优选，步骤(2)中用于叶片的不定芽诱导培养基为ms+6-ba3.0-5.0mg/l+iaa1.0-2.0mg/l，用于叶片的愈伤组织诱导培养基为ms+6-ba3-5mg/l+2,4-d0.5-1.0mg/l。
作为优选，步骤(3)中所述的增殖培养基为ms+zt0.5-1.0mg/l+naa0.05-0.10mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+苹果20g/l+椰汁100ml/l。
作为优选，步骤(4)中所述的分化培养基为ms+kt0.5-1.5mg/l+naa0.1-0.3mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+苹果20g/l+椰汁100ml/l。
作为优选，步骤(5)中所述的壮苗培养基为1/2ms+土豆10-30g/l+香蕉15-45g/l+椰汁100-200ml/l。
作为优选，所述的1/2ms培养基为：将ms培养基中的大量元素减至一半，蔗糖为15g/l，其余成分及用量与ms保持一致。
作为优选，步骤(6)中所述的生根培养基为3/4ms+naa0.01-0.05mg/l+活性炭1.0-3.0g/l。
作为优选，所述的3/4ms培养基为：将ms培养基中的大量元素减为3/4，蔗糖为22.5g/l，其余成分及用量与ms保持一致。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的贵港报春苣苔的组织培养方法具有后代长势良好，繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致和生根率高的优点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：
一种贵港报春苣苔的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：于春季取贵港报春苣苔带叶柄的幼嫩叶片，先用洗衣粉浸泡10min后在流水下冲洗干净10min，并用毛笔轻轻刷洗叶片；在超净工作台上先用棉球蘸取70％酒精拭擦叶片表面，无菌蒸馏水冲洗3次，将叶片在75％酒精中浸泡10s，无菌蒸馏水冲洗3次，再用0.1％升汞溶液处理8min，无菌蒸馏水冲洗3次；灭菌过程中轻轻震荡使酒精或升汞充分接触叶片；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100ml0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；
(2)初代诱导：将消毒灭菌好的叶片切下叶柄，余下的叶片按照以下方法切割：横切、纵切，切下的叶片要求四周均切去少许组织，保证四周均有伤口；然后将叶柄接入愈伤组织诱导培养基中培养25d，得到愈伤组织；将横切叶片和纵切叶片接入不定芽诱导培养基和愈伤组织诱导培养基中培养24d，诱导出不定芽和愈伤组织；要求叶柄、叶片的正面朝上，叶背朝下，使叶背接触培养基；所述的横切是在叶片中部位置垂直中脉切下，将叶片一分为二；所述的纵切是沿着叶片中脉将叶片切为两部分；用于叶柄的愈伤组织诱导培养基为：ms+6-ba3mg/l+2,4-d0.5mg/l；用于叶片的不定芽诱导培养基为ms+6-ba3.0mg/l+iaa1.0mg/l，用于叶片的愈伤组织诱导培养基为ms+6-ba3mg/l+2,4-d0.5mg/l；
(3)增殖培养：将从叶片直接获得的具有1对以上叶片的不定芽接入增殖培养基中培养28d；所述的增殖培养基为ms+zt0.5mg/l+naa0.05mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+苹果20g/l+椰汁100ml/l；
(4)愈伤组织分化：将从叶片诱导出来的愈伤组织切成1cm×1cm大小，然后接入分化培养基中培养30d；所述的分化培养基为ms+kt0.5mg/l+naa0.1mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+苹果20g/l+椰汁100ml/l；
(5)壮苗培养：当组培苗具有2对以上叶片时，转接于壮苗培养基中培养15d；所述的壮苗培养基为1/2ms+土豆10g/l+香蕉15g/l+椰汁100ml/l；所述的1/2ms培养基为：将ms培养基中的大量元素减至一半，蔗糖为15g/l，其余成分及用量与ms保持一致；
(6)生根培养：选取生长健壮，具有2对以上叶片的植株，转接于生根培养基中培养25d；所述的生根培养基为3/4ms+naa0.01mg/l+活性炭1.0g/l；所述的3/4ms培养基为：将ms培养基中的大量元素减为3/4，蔗糖为22.5g/l，其余成分及用量与ms保持一致。
实施例2：
一种贵港报春苣苔的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：于春季取贵港报春苣苔带叶柄的幼嫩叶片，先用洗衣粉浸泡15min后在流水下冲洗干净15min，并用毛笔轻轻刷洗叶片；在超净工作台上先用棉球蘸取70％酒精拭擦叶片表面，无菌蒸馏水冲洗5次，将叶片在75％酒精中浸泡12s，无菌蒸馏水冲洗5次，再用0.1％升汞溶液处理10min，无菌蒸馏水冲洗5次；灭菌过程中轻轻震荡使酒精或升汞充分接触叶片；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100ml0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；
(2)初代诱导：将消毒灭菌好的叶片切下叶柄，余下的叶片按照以下方法切割：横切、纵切，切下的叶片要求四周均切去少许组织，保证四周均有伤口；然后将叶柄接入愈伤组织诱导培养基中培养30d，得到愈伤组织；将横切叶片和纵切叶片接入不定芽诱导培养基和愈伤组织诱导培养基中培养30d，诱导出不定芽和愈伤组织；要求叶柄、叶片的正面朝上，叶背朝下，使叶背接触培养基；所述的横切是在叶片中部位置垂直中脉切下，将叶片一分为二；所述的纵切是沿着叶片中脉将叶片切为两部分；用于叶柄的愈伤组织诱导培养基为：ms+6-ba5mg/l+2,4-d1.0mg/l；用于叶片的不定芽诱导培养基为ms+6-ba5.0mg/l+iaa2.0mg/l，用于叶片的愈伤组织诱导培养基为ms+6-ba5mg/l+2,4-d1.0mg/l；
(3)增殖培养：将从叶片直接获得的具有1对以上叶片的不定芽接入增殖培养基中培养35d；所述的增殖培养基为ms+zt1.0mg/l+naa0.10mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+苹果20g/l+椰汁100ml/l；
(4)愈伤组织分化：将从叶片诱导出来的愈伤组织切成1cm×1cm大小，然后接入分化培养基中培养32d；所述的分化培养基为ms+kt1.5mg/l+naa0.3mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+苹果20g/l+椰汁100ml/l；
(5)壮苗培养：当组培苗具有2对以上叶片时，转接于壮苗培养基中培养18d；所述的壮苗培养基为1/2ms+土豆30g/l+香蕉45g/l+椰汁200ml/l；所述的1/2ms培养基为：将ms培养基中的大量元素减至一半，蔗糖为15g/l，其余成分及用量与ms保持一致；
(6)生根培养：选取生长健壮，具有2对以上叶片的植株，转接于生根培养基中培养28d；所述的生根培养基为3/4ms+naa0.05mg/l+活性炭3.0g/l；所述的3/4ms培养基为：将ms培养基中的大量元素减为3/4，蔗糖为22.5g/l，其余成分及用量与ms保持一致。
实施例3：
一种贵港报春苣苔的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：于春季取贵港报春苣苔带叶柄的幼嫩叶片，先用洗衣粉浸泡12min后在流水下冲洗干净12min，并用毛笔轻轻刷洗叶片；在超净工作台上先用棉球蘸取70％酒精拭擦叶片表面，无菌蒸馏水冲洗4次，将叶片在75％酒精中浸泡11s，无菌蒸馏水冲洗4次，再用0.1％升汞溶液处理9min，无菌蒸馏水冲洗4次；灭菌过程中轻轻震荡使酒精或升汞充分接触叶片；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100ml0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；
(2)初代诱导：将消毒灭菌好的叶片切下叶柄，余下的叶片按照以下方法切割：横切、纵切，切下的叶片要求四周均切去少许组织，保证四周均有伤口；然后将叶柄接入愈伤组织诱导培养基中培养28d，得到愈伤组织；将横切叶片和纵切叶片接入不定芽诱导培养基和愈伤组织诱导培养基中培养26d，诱导出不定芽和愈伤组织；要求叶柄、叶片的正面朝上，叶背朝下，使叶背接触培养基；所述的横切是在叶片中部位置垂直中脉切下，将叶片一分为二；所述的纵切是沿着叶片中脉将叶片切为两部分；用于叶柄的愈伤组织诱导培养基为：ms+6-ba4mg/l+2,4-d0.8mg/l；用于叶片的不定芽诱导培养基为ms+6-ba4.0mg/l+iaa1.5mg/l，用于叶片的愈伤组织诱导培养基为ms+6-ba4mg/l+2,4-d0.8mg/l；
(3)增殖培养：将从叶片直接获得的具有1对以上叶片的不定芽接入增殖培养基中培养30d；所述的增殖培养基为ms+zt0.8mg/l+naa0.07mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+苹果20g/l+椰汁100ml/l；
(4)愈伤组织分化：将从叶片诱导出来的愈伤组织切成1cm×1cm大小，然后接入分化培养基中培养31d；所述的分化培养基为ms+kt1.0mg/l+naa0.2mg/l+土豆30g/l+香蕉30g/l+苹果20g/l+椰汁100ml/l；
(5)壮苗培养：当组培苗具有2对以上叶片时，转接于壮苗培养基中培养16d；所述的壮苗培养基为1/2ms+土豆20g/l+香蕉30g/l+椰汁150ml/l；所述的1/2ms培养基为：将ms培养基中的大量元素减至一半，蔗糖为15g/l，其余成分及用量与ms保持一致；
(6)生根培养：选取生长健壮，具有2对以上叶片的植株，转接于生根培养基中培养26d；所述的生根培养基为3/4ms+naa0.03mg/l+活性炭2.0g/l；所述的3/4ms培养基为：将ms培养基中的大量元素减为3/4，蔗糖为22.5g/l，其余成分及用量与ms保持一致。
将上述实施例1-3得到的贵港报春苣苔的组织培养方法中不定芽诱导、愈伤组织诱导、不定芽的增殖、愈伤组织分化、生根情况进行调查统计，结果见表1。
表1本发明的贵港报春苣苔的组织培养方法对不定芽诱导、愈伤组织诱导、不定芽的增殖、愈伤组织分化、生根情况的测定
由表1可知，本发明的贵港报春苣苔的组织培养方法得到的不定芽长势良好，不定芽多；其诱导率和生根率均为100％。可见，本发明的方法具有明显的技术优势，值得进一步推广和应用。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。