用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基、培养方法及其应用与流程

一、技术领域

本发明涉及一种产生不定芽培养基、培养方法及其应用，尤其是一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基、培养方法及其应用。

二、

背景技术：

植物离体叶片不定芽再生是诱变育种、体细胞变异筛选、嵌合体分离等细胞工程育种的基础，也是遗传转化操作、外源基因转移等基因工程育种的基础，和在一个新品种或新材料较少时实现植物新品种快速繁殖的基础，因此植物叶片的离体培养被广泛应用于植物的新种质创制及新品种的培育中。

植物叶片培养始于20世纪50年代，第一个获得叶片培养成功的植物种是紫箕，之后，随着研究的深入，培养基成分得到不断的改良和完善，叶片培养成功的植物种越来越多，特别是离体体细胞诱变育种技术及植物遗传工程育种技术的应用和发展，使叶片培养研究越来越受到植物育种家的重视，因为离体体细胞诱变和植物遗传转化操作的成功应用依赖于离体叶片高效不定芽再生体系的建立，现有的植物叶片培养，获得不定芽再生成功的植物种类也在与日俱增，但由于不同物种遗传背景的复杂性，至今还不能实现对所有植物种的叶片培养再生，即使已成功的物种，由于不同类型和不同品种其基因型的差异，其再生的难易和所需的培养基条件也存在较大差异；特别是一些果树的品种其基因型高度杂合，品种之间遗传背景差异较大，很难获得同种多个品种都能成功的培养基，因此现有的组培技术都是对特定物种的类型或品种是适宜的，换一个品种或类型可能就是不适宜的或说不是最佳的，

例如树苺现在已获得了很多品种或类型绿苗的组培快繁成功，但叶片培养获得不定芽的还没有取得技术上的完全成功，现有的不同红树苺品种叶片再生不定芽的最有效植物生长调节物质都是tdz，但再生率差异较大，对红树苺品种‘费尔杜德（fertodzamatos）’进行再生不定芽的诱导，不能完成不定芽再生。

基于现有的技术问题、技术特征和技术效果，做出本发明的申请技术方案。

三、

技术实现要素：

本发明的客体是一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基，

本发明的客体是一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法，

本发明的客体是一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基和培养方法的应用。

为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基、培养方法及其应用，因此利于品种快速繁殖育苗和品种的改良。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法，其步骤是：选取红树苺离体叶片，植入到不定芽诱导培养基进行培育，形成不定芽绿苗，把不定芽绿苗植入到生根培养基进行培育，形成试管生根小植株，不定芽诱导培养基设置为：ms+3.0~10.0mg/l2ip+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或ms+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或ms+0.1~4mg/ltdz+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或nn69+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，生根培养基设置为1/4ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖。

由于设计了6－苄基氨基嘌呤（ba）、噻苯隆（tdz）、异戊烯基腺嘌呤（2ip）和吲哚丁酸（iba），通过6－苄基氨基嘌呤（ba），噻苯隆（tdz），异戊烯基腺嘌呤（2ip）和吲哚丁酸（iba）两种以上的植物生长调节物质在不定芽诱导培养基的作用，因此实现了对红树苺离体叶片的产生不定芽培养。

本发明设计了，不定芽诱导培养基设置为：ms+3.0~10.0mg/l2ip+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖。

本发明设计了，其步骤是：

一、培养条件

实验中所用的培养基都在灭菌前调ph值到5.8，然后在置121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养温度为25±2℃，光照强度为3200勒克斯（lx），光照周期为16小时/天，

二、叶片培养

选择红树苺品种‘费尔杜德（fertodzamatos）’，

a、试管苗继代增殖：

试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖，获得健壮生长用于取叶的足够试材，继代增殖培养基设置为ms+0.5~1.5mg/lba+0.01~0.5mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，

b、离体叶片培养诱导产生不定芽：

试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周，此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤，根据叶片大小切3－6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个伤口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，形成不定芽绿苗，不定芽诱导培养基设置为：ms+3.0~10.0mg/l2ip+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或ms+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或ms+0.1~4mg/ltdz+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或nn69+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，

c、不定芽绿苗生根:

切取生长高度在1.5厘米以上的不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养,培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，形成试管生根小植株，生根培养基设置为1/4ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖。

本发明设计了，其步骤是：

一、培养条件

实验中所用的培养基都在灭菌前调ph值到5.8，然后在置121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养温度为24℃，光照强度为3200勒克斯（lx），光照周期为16小时/天，

二、叶片培养

选择红树苺品种‘优系２号’，

a、试管苗继代增殖：

试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖，获得健壮生长用于取叶的足够试材，继代增殖培养基设置为ms+0.7mg/lba+0.4mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，

b、离体叶片培养诱导产生不定芽：

试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周，此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤，根据叶片大小切3－6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个伤口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，形成不定芽绿苗，不定芽诱导培养基设置为：ms+9.0mg/l2ip+0.4mg/liba+28g/l蔗糖或ms+2mg/lba+0.2mg/liba+40g/l蔗糖或ms+3mg/ltdz+0.4mg/liba+40g/l蔗糖或nn69+2mg/lba+0.2mg/liba+30g/l蔗糖，

c、形成不定芽绿苗生根:

切取生长高度在1.5厘米以上的形成不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养,培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，形成试管生根小植株，生根培养基设置为1/4ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖。

本发明设计了，一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基，设置为包含有继代增殖培养基、不定芽诱导培养基和生根培养基，。

本发明设计了，不定芽诱导培养基设置为包含有基本培养基、植物生长调节剂和碳水化合物，基本培养基设置为包含有无机营养物质和有机添加物并且碳水化合物设置为蔗糖或其它糖类物质，植物生长调节剂设置为包含有细胞分裂素类物质和生长素类物质。

本发明设计了，继代增殖培养基设置为ms+0.5~1.5mg/lba+0.01~0.5mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，不定芽诱导培养基设置为：ms+3.0~10.0mg/l2ip+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或ms+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或ms+0.1~4mg/ltdz+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或nn69+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，生根培养基设置为1/4ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖。

本发明设计了，（1）ms（murashigeandskoog）培养基,组成如下（表1）：

表1ms基本培养基组成

改良nn69培养基：组成如下（表2）：

表2nn69基本培养基组成成分

（2）植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤（ba），噻苯隆（tdz）,异戊烯基腺嘌呤（2ip），吲哚丁酸（iba），

（3）碳源：蔗糖，

（4）无离子水，

（5）琼脂粉。

本发明设计了，继代增殖培养基设置为ms+0.7mg/lba+0.5mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，不定芽诱导培养基设置为：ms+9.0mg/l2ip+0.2mg/liba+29g/l~40g/l蔗糖，生根培养基设置为1/4ms+0.9mg/liba+20g/l蔗糖。

本发明设计了，一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法和用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基的实施例在红树苺品种‘费尔杜德’离体叶片再生不定芽的应用。

本发明设计了，一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法和用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基在红树苺品种‘优系２号’离体叶片再生不定芽的应用。

在本技术方案中，植物叶片的离体培养，是指在无菌和人工控制环境条件下，以离体叶片为外植体，利用适当的培养基及培养方法诱导叶片产生不定芽的技术。

本发明的技术效果在于：试管苗继代增殖。实验室建立保存的红树苺品种‘费尔杜德’试管苗在增殖培养基上进行继代增殖培养，获得健壮生长的试管绿苗，为叶片培养提供足够试材，叶片培养诱导产生不定芽，试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周时，取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤,依据叶片大小，切3－6刀不等，至少一边的叶缘不切断，使叶片是一个有多个切口的完整叶片。把有伤口的叶片逐个接种在不定芽诱导培养基上。不定芽诱导培养基包括基本培养基、植物生长调节剂和碳水化合物。基本培养基主要包括无机营养物质（大量营养元素和微量营养元素）和有机添加物。碳水化合物通常是蔗糖或其他糖类物质，碳水化合物的作用主要是作为培养基内的碳源和能源，并对维持培养基的渗透压起重要作用。植物生长调节剂主要包括细胞分裂素类物质和生长素类物质，其作用是调控植物生长和发育，促进细胞分裂、扩大、伸长、诱导芽的分化及促进试管苗的生根等，试管苗的生根，试管苗的生根是植物组培快繁中关键的一步，生根的失败就可能导致组培快繁的失败。选用适宜的生根培养基进行试管苗生根诱导。目的是获得组织培养试管绿苗的生根小植株，再把这些生根小植株从瓶内移栽到瓶外，获得育种的新材料或无性繁殖的试管苗，实现优良品种试管苗工厂化生产，针对树苺品种‘费尔杜德’叶片再生不定芽困难这一问题，能有效克服叶片不定芽不能再生和再生率低的难题，成功获得高效叶片不定芽再生。不定芽继代繁殖后的绿苗成功获得生根，对于该优良品种的无性快繁育苗、植物细胞工程及基因工程的遗传改良也有很好的技术启示。

在本技术方案中，生根培养基中的1/4ms表示生根培养基中ms的重量是不定芽诱导培养基中ms的重量的1\4即根培养基中ms的重量与不定芽诱导培养基中ms的重量的比例设置为1：4。

在本技术方案中，以异戊烯基腺嘌呤（2ip和吲哚丁酸（iba）的不定芽诱导培养基为重要技术特征，在用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基、培养方法及其应用的技术领域中，具有新颖性、创造性和实用性，在本技术方案中的术语都是可以用本技术领域中的专利文献进行解释和理解。

四、附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的试管苗继代增殖的生长效果图：

图2为本发明的离体叶片培养诱导产生不定芽的生长效果图：

a图不定芽诱导培养基为:ms+3.0~10.0mg/l2ip+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，

b图不定芽诱导培养基为:ms+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，

c不定芽诱导培养基为:ms+0.1~4mg/ltdz+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，

d不定芽诱导培养基为:nn69+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，

图3为本发明的不定芽绿苗生根的生长效果图：

五、具体实施方式

根据审查指南，对本发明所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语应当理解为不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法，下面结合实施例，对本发明进一步描述，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。第一个实施例，其步骤是：

一、培养条件

实验中所用的培养基都在灭菌前调ph值到5.8，然后在置121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养温度为25℃，光照强度为3200勒克斯（lx），光照周期为16小时/天，

二、叶片培养

选择红树苺品种‘费尔杜德（fertodzamatos）’，

a、试管苗继代增殖：

试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖，获得健壮生长用于取叶的足够试材，继代增殖培养基设置为ms+0.5mg/lba+0.01mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，

b、离体叶片培养诱导产生不定芽：

试管苗在继代增殖培养基上生长4周，此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤，根据叶片大小切3刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个伤口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，形成不定芽绿苗，不定芽诱导培养基设置为：ms+3.0mg/l2ip+0.1mg/liba+20g/l蔗糖，

c、形成不定芽绿苗生根:

切取生长高度在1.5厘米的形成不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养,培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，形成试管生根小植株，生根培养基设置为1/4ms(ms无机成分减少到原来的1/4)+0.1mg/liba+20g/l蔗糖。

本实施例的实验结果：

1.试管苗的增殖生长

试管苗在继代培养基ms+0.5~1.5mg/lba+0.01~0.5mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖上增殖生长良好。表现为既有增殖生长又有伸长生长，叶展且叶色绿(图1)，便于叶片试材的采集和切取，是较理想的增殖培养基。

2.叶片培养诱导产生不定芽

叶片产生不定芽的适宜培养基为ms+3.0~10.0mg/l2ip+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，不定芽再生率达88%，且单位叶片不定芽数多（图2，a）；在培养基ms+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖（图2，b）和ms+0.1~4mg/ltdz+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖（图2，c），再生率仅为15%；在培养基nn69+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖（图2，d）及nn69+2~9mg/l2ip+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，不定芽再生率在22%以下，且每叶仅产生1芽。

4试管苗的生根

健康绿苗在生根培养基1/4ms+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖上培养20天,生根率在85%以上，说明所选用生根培养基能有效诱导‘费尔杜德’试管苗的生根（图３）。

第二个实施例，其步骤是：

一、培养条件

实验中所用的培养基都在灭菌前调ph值到5.8，然后在置121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养温度为27℃，光照强度为3200勒克斯（lx），光照周期为16小时/天，

二、叶片培养

选择红树苺品种‘费尔杜德（fertodzamatos）’，

a、试管苗继代增殖：

试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖，获得健壮生长用于取叶的足够试材，继代增殖培养基设置为ms+1.5mg/lba+0.5mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，

b、离体叶片培养诱导产生不定芽：

试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周，此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤，根据叶片大小切3－6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个伤口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，形成不定芽绿苗，不定芽诱导培养基设置为：ms+10.0mg/l2ip+0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，

c、形成不定芽绿苗生根:

切取生长高度在1.5厘米以上的形成不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养,培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，形成试管生根小植株，生根培养基设置为1/4ms(ms无机成分减少到原来的1/4)+1mg/liba+20g/l蔗糖。

第三个实施例，其步骤是：

一、培养条件

实验中所用的培养基都在灭菌前调ph值到5.8，然后在置121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养温度为23℃，光照强度为3200勒克斯（lx），光照周期为16小时/天，

二、叶片培养

选择红树苺品种‘费尔杜德（fertodzamatos）’，

a、试管苗继代增殖：

试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖，获得健壮生长用于取叶的足够试材，继代增殖培养基设置为ms+1.0mg/lba+0.2mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，

b、离体叶片培养诱导产生不定芽：

试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周，此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤，根据叶片大小切3－6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个伤口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，形成不定芽绿苗，不定芽诱导培养基设置为：ms+6.0mg/l2ip+0.3mg/liba+30g/l蔗糖，

c、形成不定芽绿苗生根:

切取生长高度在1.5厘米以上的形成不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养,培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，形成试管生根小植株，生根培养基设置为1/4ms(ms无机成分减少到原来的1/4)+0.6mg/liba+20g/l蔗糖。

第四个实施例，其步骤是：

一、培养条件

实验中所用的培养基都在灭菌前调ph值到5.8，然后在置121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养温度为25±2℃，光照强度为3200勒克斯（lx），光照周期为16小时/天，

二、叶片培养

选择红树苺品种‘费尔杜德（fertodzamatos）’，

a、试管苗继代增殖：

试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖，获得健壮生长用于取叶的足够试材，继代增殖培养基设置为ms+0.5~1.5mg/lba+0.01~0.5mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，

b、离体叶片培养诱导产生不定芽：

试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周，此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤，根据叶片大小切3－6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个伤口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，形成不定芽绿苗，不定芽诱导培养基设置为：ms+3.0~10.0mg/l2ip+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或ms+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或ms+0.1~4mg/ltdz+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或nn69+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，

c、形成不定芽绿苗生根:

切取生长高度在1.5厘米以上的形成不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养,培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，形成试管生根小植株，生根培养基设置为1/4ms(ms无机成分减少到原来的1/4)+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖。

第五个实施例，其步骤是：

一、培养条件

实验中所用的培养基都在灭菌前调ph值到5.8，然后在置121℃，1个大气压下高压灭菌20分钟，培养室培养温度为24℃，光照强度为3200勒克斯（lx），光照周期为16小时/天，

二、叶片培养

选择红树苺品种‘费尔杜德（fertodzamatos）’，

a、试管苗继代增殖：

试管苗在继代增殖培养基上进行继代增殖，获得健壮生长用于取叶的足够试材，继代增殖培养基设置为ms+0.7mg/lba+0.4mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，

b、离体叶片培养诱导产生不定芽：

试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周，此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤，根据叶片大小切3－6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个伤口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，形成不定芽绿苗，不定芽诱导培养基设置为：ms+9.0mg/l2ip+0.4mg/liba+28g/l蔗糖或ms+2mg/lba+0.2mg/liba+40g/l蔗糖或ms+3mg/ltdz+0.4mg/liba+40g/l蔗糖或nn69+2mg/lba+0.2mg/liba+30g/l蔗糖，

c、形成不定芽绿苗生根:

切取生长高度在1.5厘米以上的形成不定芽绿苗转移到生根培养基上进行生根培养,培养条件为先连续暗培养7天，然后转到16小时光周期培养条件下培养，形成试管生根小植株，生根培养基设置为1/4ms(ms无机成分减少到原来的1/4)+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖。

第六个实施例之一，离体叶片培养诱导产生不定芽：

试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周，此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤，根据叶片大小切3－6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个伤口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，形成不定芽绿苗，不定芽诱导培养基设置为：ms+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖。

第六个实施例之二，不定芽诱导培养基设置为：ms+5mg/lba+0.5mg/liba+40g/l蔗糖。

第六个实施例之三，不定芽诱导培养基设置为：ms+1mg/lba+0.1mg/liba+20g/l蔗糖。

第六个实施例之四，不定芽诱导培养基设置为：ms+3mg/lba+0.3mg/liba+30g/l蔗糖。

第七个实施例之一，离体叶片培养诱导产生不定芽：

试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周，此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤，根据叶片大小切3－6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个伤口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，形成不定芽绿苗，不定芽诱导培养基设置为：ms+0.1~4mg/ltdz+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖。

第七个实施例之二，不定芽诱导培养基设置为：ms+4mg/ltdz+0.5mg/liba+40g/l蔗糖。

第七个实施例之三，不定芽诱导培养基设置为：ms+0.1mg/ltdz+0.1mg/liba+20g/l蔗糖。

第七个实施例之四，不定芽诱导培养基设置为：ms+3mg/ltdz+0.3mg/liba+30g/l蔗糖。

第八个实施例之一，离体叶片培养诱导产生不定芽：

试管苗在继代增殖培养基上生长4－5周，此时切取健壮绿苗顶端刚展开幼嫩叶片，用无菌手术刀片垂直于叶片中脉横切伤，根据叶片大小切3－6刀，至少一边的叶缘不切断，保持叶片是一个带多个伤口的完整叶片，把切好的叶片接种在不定芽诱导培养基，形成不定芽绿苗，不定芽诱导培养基设置为：nn69+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖。

第八个实施例之二，不定芽诱导培养基设置为：nn69+3mg/lba+0.3mg/liba+30g/l蔗糖。

第八个实施例之三，不定芽诱导培养基设置为：nn69+5mg/lba+0.5mg/liba+40g/l蔗糖。

第八个实施例之四，不定芽诱导培养基设置为：nn69+1mg/lba+0.1mg/liba+20g/l蔗糖。

其中第二至八个实施例是以第一个实施例为基础。

一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基，第一个实施例，设置为包含有继代增殖培养基、不定芽诱导培养基和生根培养基。

在本实施例中，不定芽诱导培养基设置为包含有基本培养基、植物生长调节剂和碳水化合物，基本培养基设置为包含有无机营养物质和有机添加物并且碳水化合物设置为蔗糖或其它糖类物质，植物生长调节剂设置为包含有细胞分裂素类物质和生长素类物质。

在本实施例中，继代增殖培养基设置为ms+0.5~1.5mg/lba+0.01~0.5mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，不定芽诱导培养基设置为：ms+3.0~10.0mg/l2ip+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或ms+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或ms+0.1~4mg/ltdz+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖或nn69+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖，生根培养基设置为1/4ms(ms无机成分减少到原来的1/4)+0.1～1mg/liba+20g/l蔗糖。

在本实施例中，（1）ms（murashigeandskoog）培养基,组成如下（表1）：

表1ms基本培养基组成

改良nn69培养基：组成如下（表2）：

表2nn69基本培养基组成成分

（2）植物生长调节物质：6－苄基氨基嘌呤（ba），噻苯隆（tdz）,异戊烯基腺嘌呤（2ip）吲哚丁酸（iba），

（3）碳源：蔗糖，

（4）无离子水，

（5）琼脂粉。

第二个实施例，继代增殖培养基设置为ms+0.5mg/lba+0.01mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，不定芽诱导培养基设置为：ms+3.0mg/l2ip+0.1mg/liba+20g/l蔗糖，生根培养基设置为1/4ms(ms无机成分减少到原来的1/4)+0.1mg/liba+20g/l蔗糖。

第三个实施例，继代增殖培养基设置为ms+1.5mg/lba+0.5mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，不定芽诱导培养基设置为：ms+10.0mg/l2ip+0.5mg/liba+40g/l蔗糖，生根培养基设置为1/4ms(ms无机成分减少到原来的1/4)+1mg/liba+20g/l蔗糖。

第四个实施例，继代增殖培养基设置为ms+1.0mg/lba+0.3mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，不定芽诱导培养基设置为：ms+7mg/l2ip+0.3mg/liba+30g/l蔗糖，生根培养基设置为1/4ms(ms无机成分减少到原来的1/4)+0.6mg/liba+20g/l蔗糖。

第五个实施例，继代增殖培养基设置为ms+0.7mg/lba+0.5mg/liba+6g/l琼脂+30g/l蔗糖，不定芽诱导培养基设置为：ms+9.0mg/l2ip+0.2mg/liba+29g/l~40g/l蔗糖，生根培养基设置为1/4ms(ms无机成分减少到原来的1/4)+0.9mg/liba+20g/l蔗糖。

第六个实施例之一，不定芽诱导培养基设置为：ms+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖。

第六个实施例之二，不定芽诱导培养基设置为：ms+5mg/lba+0.5mg/liba+40g/l蔗糖。

第六个实施例之三，不定芽诱导培养基设置为：ms+1mg/lba+0.1mg/liba+20g/l蔗糖。

第六个实施例之四，不定芽诱导培养基设置为：ms+3mg/lba+0.3mg/liba+30g/l蔗糖。

第七个实施例之一，不定芽诱导培养基设置为：ms+0.1~4mg/ltdz+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖。

第七个实施例之二，不定芽诱导培养基设置为：ms+4mg/ltdz+0.5mg/liba+40g/l蔗糖。

第七个实施例之三，不定芽诱导培养基设置为：ms+0.1mg/ltdz+0.1mg/liba+20g/l蔗糖。

第七个实施例之四，不定芽诱导培养基设置为：ms+3mg/ltdz+0.3mg/liba+30g/l蔗糖。

第八个实施例之一，不定芽诱导培养基设置为：nn69+1~5mg/lba+0.1~0.5mg/liba+20g/l~40g/l蔗糖。

第八个实施例之二，不定芽诱导培养基设置为：nn69+3mg/lba+0.3mg/liba+30g/l蔗糖。

第八个实施例之三，不定芽诱导培养基设置为：nn69+5mg/lba+0.5mg/liba+40g/l蔗糖。

第八个实施例之四，不定芽诱导培养基设置为：nn69+1mg/lba+0.1mg/liba+20g/l蔗糖。

其中第二至八个实施例是以第一个实施例为基础。

一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法和用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基的实施例在红树苺品种‘费尔杜德’离体叶片再生不定芽的应用。

当选择红树苺品种‘优系２号’时，用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法的第一至八实施例都可以实施但第五个实施例的效果最好和用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基的的第一至八实施例都可以实施但第五个实施例的效果最好。

一种用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养方法和用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基在红树苺品种‘优系２号’离体叶片再生不定芽的应用。

本发明具有下特点：

1、由于设计了6－苄基氨基嘌呤（ba）、噻苯隆（tdz）和异戊烯基腺嘌呤（2ip）、吲哚丁酸（iba）、通过6－苄基氨基嘌呤（ba）、噻苯隆（tdz）和异戊烯基腺嘌呤（2ip）、吲哚丁酸（iba）两种以上的植物生长调节物质在不定芽诱导培养基的作用，不再单独使用噻苯隆（tdz），因此实现了对红树苺离体叶片的产生不定芽培养。

2、由于设计了继代增殖培养基，满足了离体叶片的生长需要。

3、由于设计了不定芽诱导培养基，通过不定芽诱导培养基的作用，对离体叶片产生诱导不定芽的作用。

4、由于设计了生根培养基，满足了离体叶片不定芽生根的需要。

5、由于设计了对结构形状进行了数值范围的限定，使数值范围为本发明的技术方案中的技术特征，不是通过公式计算或通过有限次试验得出的技术特征，试验表明该数值范围的技术特征取得了很好的技术效果。

6、由于设计了本发明的技术特征，在技术特征的单独和相互之间的集合的作用，通过试验表明，本发明的各项性能指标为现有的各项性能指标的至少为1.7倍，通过评估具有很好的市场价值。

还有其它的与以异戊烯基腺嘌呤（2ip和吲哚丁酸（iba）的不定芽诱导培养基相同或相近似的技术特征都是本发明的实施例之一，并且以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为满足专利法、专利实施细则和审查指南的要求，不再对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合的实施例都进行描述。

上述实施例只是本发明所提供的用于红树苺离体叶片的产生不定芽培养基、培养方法及其应用的一种实现形式，根据本发明所提供的方案的其他变形，增加或者减少其中的成份或步骤，或者将本发明用于其他的与本发明接近的技术领域，均属于本发明的保护范围。