专利名称：一种豆荚内特异表达毒蛋白的转基因植物的制作方法
技术领域：
生物、农业。
现有技术(与本发明最接近的技术)早在1991年，荷兰的植物遗传系统公司(Plant Genetic Syst.)就专利了用苏云金毒蛋白(BtToxin)转化植物，进行农作物防虫治虫的技术(91-339820)，美国的Agracetus公司专利了用转蝎毒和Bt双价基因获得植物抗虫性的技术(91-173090)。此后，全世界已有许多家公司或大学相继专利了用不同毒蛋白基因转化植物，获得抗虫性技术。澳大利亚的Agric Genetics公司专利了在植物韧皮部中表达昆虫毒蛋白或昆虫代谢产物抑制剂蛋白、获得抗虫性的技术(93-094007)；Mycogen Plant Science公司在1995年专利了用人工合成的Bt基因和高表达启动子获得转基因抗虫植物的技术(95-384255)；美国Cornell大学则专利了伤害特异性表达启动子指导的抗虫性(93-134024)。
发明的目的防止昆虫毒蛋白在植物可食用部位的累积，提高基因工程抗虫植物对人类的安全系数。
随着世界人口的不断增长和对粮、棉、油的需求日益增加，农作物的高产稳产已成为农业发展的当务之急。虫害是造成农业减产的重要原因之一，据估计，全球范围内虫害造成的损失约占农作物总收获量的10-15％，每年高达数千亿美元。大豆食心虫(Leguminivoraglycinivorella)是我国最主要的大豆害虫，在全国、尤其是大豆主栽区——东北及黄淮海流域普遍发生，危害大豆的豆荚和籽粒，造成虫口，碎粒等，增加自然脱粒，降低品质和产量。该虫的主要生物学特性是食性单一，每年一代，只危害大豆和野生大豆，成虫发生期短，幼虫蛀入荚内取食豆粒。由于生产上主推品种抗虫性不强，轮作体制不完善，近年来该虫已呈蔓延趋势，严重制约了我国的大豆生产。虫害发生较轻时，虫食率一般在5-10％左右，严重的年份和地区可高达30％以上，有的甚至达到40-50％！全国常年播种大豆1亿亩左右，仅按5％的损失率算，就相当于每年减少播种面积500万亩；若以每亩单产110公斤、每公斤售价2.30元计算，直接经济损失高达12.65亿元/年。因此，防治大豆食心虫已经成为我国农业发展中的一个重要课题。
回顾害虫防治方法和策略的演变过程，我们不难发现全世界都走了弯路。从本世纪40年代开始，由于化学农药的问世，许多优秀的传统农业技术，如害虫的天敌、作物内在的抗性选择及栽培措施的利用等均未能得到应有的重视。近半个世纪的生产实践证明，长期、广泛、大量、连续施用化学农药，已经带来了一系列破坏性副作用。第一，由于害虫产生抗药性，导致用药量越来越大，用药次数越来越频繁，严重地污染了环境，影响家禽家畜和野生动物的安全性，并威胁人类健康；第二，广谱杀虫剂往往导致害虫的天敌迅速灭亡，害虫因为失去天然竞争对手而繁殖失控，大大降低了防治效果，甚至引起周而复始的害虫大爆发。据有关部门统计，1991至1994年间我国北方及长江流域棉区棉铃虫连续爆发，每年直接经济损失约60亿元，其中1992年更高达100亿元。
因此，有效地防治害虫是增加农业收入的关键措施之一，对我国国民经济的发展有着举足重轻的影响。但是，常规育种技术不仅周期长，效率相对较低，而且育成的品种往往带有不良农业性状，造成不同程度的产量、质量下降。用基因工程的手段将抗虫基因引入农作物细胞中并使其稳定表达和遗传，从而培育抗虫作物新品种已经成为现代农业发展的方向。首先，抗虫品种对作物具有连续保护作用，能在任何发育阶段控制害虫的发生；其次，抗虫品种只杀死摄食害虫，对非危害生物没有影响；第三，抗虫品种不污染环境，不破坏生态平衡；第四，与常规育种或发展新型杀虫剂相比，基因工程育种技术因为具有投资少、成本低、见效快等优点而在国内外独树一帜。
自从1983年世界上第一例转基因烟草和马铃薯同时获得成功以来，转基因植物技术被广泛应用于提高植物的抗逆性、改良作物品质，并不断被用作生物反应器，生产有益于人类的化合物或多肽。有关转基因植物的研究及其应用已经受到全世界科学家、各国政府部门和许多生物公司的关注。截止94年底，全球已有超过1500例转基因植物进入大田试验，说明基因工程已经成为作物品种改良的重要途径。
最近的统计表明，苏云金杆菌毒蛋白基因(Bacillusthuringiensis，insecticidal crystal protein--ICP，又称Bt-toxin)可能是世界范围内应用最广泛的抗虫基因。比利时植物遗传系统公司、美国孟山都公司和Agracetus公司及中国农科院生物中心都先后获得了转化Bt基因的烟草、番茄和棉花，其中有些已经开始在生产上发挥作用。通常情况下，苏云金杆菌的ICP蛋白以原毒素的形式进入昆虫幼虫的中肠道，并被蛋白水解酶水解成为毒性多肽分子。活化了的毒素能与敏感昆虫中肠道上皮细胞表面受体相互作用，形成膜孔道，破坏细胞的渗透压和离子平衡，引起细胞肿胀甚至裂解，幼虫停止进食，饥饿而死。然而，Bt毒蛋白的应用也存在不少问题。一是ICP抗虫谱相对较窄。虽然目前已分离到众多的ICP基因，几乎覆盖了全部鳞翅目害虫，但具体而言，每种ICP的抗虫谱都较窄；二是昆虫易对ICP产生耐受性。印度谷螟长期饲喂含有ICP的人工饲料后产生明显的耐受性，其半致死剂量提高了250倍。其它许多昆虫也在实验条件下产生了不同程度的耐受性。研究表明，ICP毒性降低的主要原因是它与幼虫中肠道上皮细胞表面受体的亲和力降低了。因为转基因植物往往使用单一ICP基因，昆虫产生耐受性的问题将更为突出。
所以，尽快克服害虫耐受性是当前抗虫植物基因工程面临的关键问题。科学上一般采用以下三种方法第一，同时使用两个以上的ICP基因转化农作物，即使害虫对其中一种毒蛋白产生耐受性，也不至于丧失植物的抗虫能力。这个方法可能并不好，因为前述印度谷螟等都是在饲喂混合Bt毒蛋白时产生耐受性的。第二，引入特异表达机制，使导入植物的ICP基因只在受害虫攻击侵害时或只在作物易受害虫攻击部位高效表达，减少产生耐受昆虫种群的环境选择压。这个方法可能在一定程度上延缓害虫耐受性的发生，但并不能从根本上解决问题。防止害虫耐受性发生最有效的方法是联合使用ICP或其它不同功能的、昆虫特异性毒蛋白基因，如蝎毒基因、胰蛋白酶抑制剂基因、α-淀粉酶基因等，保证转基因植物同时表达数个具有不同毒性机制的蛋白，既拓展了抗虫谱，又使得昆虫难以产生耐受性，具有广阔的应用前景。问题在于，如果人类，尤其是婴儿、小孩和老人，长期食用这些含有毒蛋白的转基因种子，会不可避免地产生某些不良反应。而克隆分离豆荚特异表达基因的启动子，将这个(些)启动子插入BmkIT毒蛋白基因上游，导入农杆菌中间载体后转化大豆外植体，获得具有抗虫性、但种子中没有任何毒蛋积累的新型工程大豆株系，可能是克服这个难题的唯一有效方法，肯定会在生产上发挥巨大的作用。
内容及方案克隆豆荚特异性表达基因并获得指导这个(些)基因特异表达的启动子，插入东亚钳蝎昆虫毒蛋白Bmk IT编码区上游，构成嵌合基因，通过介体导入植物染色体DNA中，获得带有豆荚特异表达启动子和昆虫毒蛋白基因Bmk IT的工程植物(见图1)。该植物具有较强的抗虫性，但种子内不积累或基本不积累(＜大豆总蛋白的0.0001％)昆虫毒蛋白。
优点及效果1).该转基因植物具有显著的抗虫性，能在很大程度上减轻虫害，提高大豆的产量和品质；2).该大豆种子内没有表达昆虫毒蛋白，提高了人类食用安全系数。
图1.嵌合启动子的构建及基因在豆荚内的特异表达示意实施例本实验设计方案为图权利要求
1.一种豆荚内特异表达毒蛋白的转基因植物，其特征是(1)克隆得到控制植物豆荚内特异表达基因的启动子；(2)将该启动子克隆到昆虫毒蛋白编码区(基因)的5′上游端；(3)所转化基因只在豆荚内表达，该植物种子内没有或只有极微量昆虫毒蛋白的累积；(4)能显著提高食用转基因植物种子的安全性。
2.根据权利要求1(3)所述，其特征在于将仅在豆荚内特异表达的启动子与毒蛋白基因相连，构成嵌合基因和表达载体，转化植物后获得豆荚内表达毒蛋白，对昆虫有毒杀作用，但种子内没有这种毒蛋白积累的植株。
3.根据权利要求1(4)所述，其特征在于这种转基因植物种子食用的安全性，这一设想可以在玉米、豆类、花生和油菜等农作物品种及许多核果类木本植物上实现。
全文摘要
克隆控制豆荚内特异表达基因的启动子；将该启动子克隆到任何昆虫毒蛋白编码区(基因)的5′上游端；用常规方法导入植物并获得转基因抗虫株系；所转化基因只在豆荚内表达，该植物种子内没有或只有极微量昆虫毒蛋白的累积；在农业生产上推广这一技术后，能显著提高食用转基因植物种子的安全性。
文档编号A01H1/06GK1143113SQ9610481
公开日1997年2月19日 申请日期1996年4月30日 优先权日1996年4月30日
发明者朱玉贤 申请人:北京大学